EV71感染相關(guān)miRNA篩選及FNC抗EV71活性研究.pdf

1、手足口病被列為我國法定丙類傳染病，其發(fā)病率和死亡率在丙類傳染病中居首，已成為嚴(yán)重危害嬰幼兒健康和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。感染手足口病的病原體有：腸道病毒71型（enterovirus71,EV71)、柯薩奇病毒 A組（Coxasckievirus A group，CVA）和柯薩奇病毒 B組（Coxasckievirus B group，CVB），以EV71和CVA16最為常見。EV71除了引起手、足、口和粘膜部位出現(xiàn)皰疹以及發(fā)熱外，還

2、會(huì)出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、心肌炎、急性弛緩性麻痹等疾病，特別是一些重癥患兒發(fā)展比較迅速易出現(xiàn)死亡。該病毒主要感染嬰幼兒，尤其是6歲以下的兒童。目前臨床上尚無特效的抗EV71藥物，只能是對(duì)癥療法。EV71動(dòng)物感染模型的缺乏嚴(yán)重阻礙了腸道病毒71型治療藥物及抗病毒靶標(biāo)研究。
　　目的：獲得EV71乳鼠適應(yīng)株，建立EV71感染乳鼠模型，為抗EV71藥物的篩選和活性評(píng)價(jià)提供穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型；研究EV71感染相關(guān)宿主

3、miRNA，為EV71感染防治提供潛在新型抗病毒藥物靶標(biāo)，并為研究宿主抗EV71防御機(jī)制提供更為深層次的理解；研究核苷類小分子藥物FNC對(duì)EV71復(fù)制的抑制作用，并初步探討其抗病毒作用機(jī)制，為EV71病毒感染的預(yù)防和治療提供先導(dǎo)化合物或候選藥物。
　　方法：1）EV71（BrCr）株病毒通過在1日齡ICR乳鼠上連續(xù)傳代8次，建立EV71（BrCr）株動(dòng)物適應(yīng)株模型；通過對(duì)各適應(yīng)株病毒RNA拷貝數(shù)的測定和乳鼠感染各病毒適應(yīng)株后死亡率

4、計(jì)算觀察各適應(yīng)株的毒力增減情況；通過對(duì)適應(yīng)株病毒的全基因測序比對(duì)突變位點(diǎn)；通過在Vero細(xì)胞上大量擴(kuò)增EV71（H）株病毒，用腹腔注射的方法感染12日ICR乳鼠建立EV71（H）株動(dòng)物模型。2）應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選預(yù)測EV71感染相關(guān)宿主miRNA，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測預(yù)測出來的宿主miRNA在EV71感染前后的表達(dá)變化，合成制備相應(yīng)宿主miRNA inhibitor，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后感染病毒，通過CPE法、空斑法、熒光定量PCR法、

5、免疫熒光和免疫印跡的方法測定相應(yīng)miRNA抑制劑對(duì)EV71病毒的抑制作用。3）CCK8法篩選出具有抗EV71病毒活性的藥物；通過CCK8法測定FNC在Vero細(xì)胞和RD細(xì)胞上的細(xì)胞毒性和對(duì)EV71感染致細(xì)胞病變的抑制作用，通過免疫熒光法、空斑形成法及免疫印跡法檢測FNC對(duì)EV71感染細(xì)胞后上清液中病毒滴度的影響和細(xì)胞中VP1蛋白表達(dá)的影響；進(jìn)一步機(jī)制研究，檢測FNC對(duì)EV71病毒的直接滅活作用、EV71病毒生活周期的影響及3C蛋白酶活性

6、的影響；病毒在RD細(xì)胞上連續(xù)傳代14次同時(shí)給予FNC抑制病毒，檢測EV71對(duì)FNC的耐藥性。
　　結(jié)果：1）成功建立了EV71（BrCr）株動(dòng)物模型，且隨著適應(yīng)代數(shù)的增加毒力有所加強(qiáng)，感染P8-1J-V病毒后能使7日齡ICR和BALB/c乳鼠死亡率達(dá)到100％；通過對(duì)P8-1J-V全基因測序發(fā)現(xiàn)有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變（1819：C→T；2428：C→G；2731：A→G；5259：G→A）；成功建立EV71（H）株動(dòng)物模型，且不論是

7、病毒原液還是病毒5倍稀釋液感染12日齡ICR乳鼠后死亡率均達(dá)到70%以上。2）經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測，hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210可能與EV71復(fù)制相關(guān)。熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著感染時(shí)間的增加感染EV71病毒后hsa-miR-146a、hsa-miR-155、hsa-miR-210的表達(dá)量逐漸增加。轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miRNA抑制劑能抑制EV71病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變，減少培養(yǎng)液中EV71

8、病毒的病毒滴度和病毒RNA的拷貝數(shù)，減少EV71病毒VP1蛋白的表達(dá)。3）篩藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FNC具有抗EV71病毒活性；FNC抑制EV71致細(xì)胞病變，病毒梯度稀釋（MOI分別為10、1和0.1）后感染RD和Vero細(xì)胞，其IC50值分別為（88.40±17.99）、（66.07±5.27）、（33.76±4.65）nM；（10.16±2.46）、（12.08±2.07）、（6.40±2.317）nM；FNC能顯著降低病毒感染后上清中病毒滴度

9、和細(xì)胞中VP1蛋白的表達(dá)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NC無直接殺病毒作用；FNC對(duì)病毒生活周期的復(fù)制階段作用較明顯（P＜0.05）；0.33g/mL的FNC對(duì)3C蛋白酶的活性有微弱的抑制作用。耐藥性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，200、100nM的FNC連續(xù)14次抑制病毒后對(duì)EV71致細(xì)胞病變作用未見明顯變化。
　　結(jié)論：初步建立了EV71（BrCr）株和EV71（H）株手足口病乳鼠動(dòng)物模型；hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-155-5p、hsa