PLAC8在EV71感染致病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、腸道病毒71型（EV71）是嬰幼兒重癥手足口病的主要病原體之一，可導(dǎo)致腦干腦炎、肺水腫等組織病變，嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康成長(zhǎng)。EV71感染死亡病例的腦干、脊髓、肺間質(zhì)中均可觀察到中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，說(shuō)明EV71感染導(dǎo)致的組織炎癥反應(yīng)損傷在EV71感染致病中起重要作用。然而，EV71感染導(dǎo)致一系列炎性反應(yīng)以及為什么只在嬰幼兒階段感染致病的分子機(jī)制尚不清楚。為了揭示EV71在嬰兒體內(nèi)感染致炎性病變的機(jī)制，本研究利用EV71感染小鼠腦組織基因芯片

2、篩選可能在組織炎性損傷中發(fā)揮作用的靶標(biāo)蛋白。
　　首先我們通過(guò)腹腔注射EV71病毒到1日齡昆明乳鼠，建立EV71感染小鼠模型。分別在感染三天及六天時(shí)，采取感染組及對(duì)照組小鼠腦組織，提取RNA，進(jìn)行Affymetrix基因芯片檢測(cè)，篩選差異表達(dá)基因。通過(guò)KEGG聚類分析及差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因大都與抗病毒免疫相關(guān)。而其中，在感染三天及六天均上調(diào)表達(dá)的PLAC8基因目前的功能報(bào)道大都集中于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、癌癥進(jìn)程方面。然

3、而在HBV感染清除以及感染導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥患者體內(nèi)均檢測(cè)到了PLAC8基因的差異表達(dá)。以上報(bào)道及結(jié)果均表明，PLAC8很可能在抗病毒免疫中發(fā)揮了重要的作用。因此，本研究以PLAC8為對(duì)象，研究其在EV71感染中可能發(fā)揮的功能。
　　EV71主要感染5歲以下的嬰幼兒，而重病患者大都在三歲以下。用EV71分別感染1日齡、2日齡、3日齡昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)1日齡小鼠感染后相繼出現(xiàn)消瘦、四肢無(wú)力、癱瘓等明顯病變，感染七天后全部死亡。2日齡小鼠較1

4、日齡小鼠的病變率和死亡率顯著降低，感染第七天死亡率為20％。而3日齡小鼠基本無(wú)明顯病變及死亡。說(shuō)明EV71在小鼠中的感染也與年齡相關(guān)，乳鼠更易感。因此，可以利用EV71感染小鼠模型研究EV71感染與年齡的關(guān)系。
　　為了研究PLAC8是否與EV71感染的年齡依賴性相關(guān)，對(duì)不同年齡小鼠肺組織中PLAC8的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PLAC8的mRNA和蛋白表達(dá)均隨年齡增加而顯著下調(diào)。同時(shí)我們收集了小于3歲年齡組、3-12歲年齡

5、組和12-18歲年齡組健康人外周血，每組各12-20人，提取全血RNA后，Real-time檢測(cè)外周血白細(xì)胞中PLAC8基因的mRNA表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在人體中，PLAC8的表達(dá)量也隨年齡增長(zhǎng)而顯著下調(diào)。說(shuō)明PLAC8很有可能與EV71在嬰幼兒中更易感相關(guān)。
　　隨后，在肺癌細(xì)胞A549中過(guò)表達(dá)PLAC8，發(fā)現(xiàn)PLAC8的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)EV71的增殖。并且在感染早期，6小時(shí)的時(shí)候，PLAC8過(guò)表達(dá)細(xì)胞中可顯著檢測(cè)到EV71結(jié)構(gòu)蛋白VP1的

6、表達(dá)，而此時(shí)對(duì)照組細(xì)胞中檢測(cè)不到VP1蛋白的表達(dá)。說(shuō)明PLAC8在EV71感染的早期即可促進(jìn)病毒的增殖。分析其可能的原因有：PLAC8促進(jìn)病毒受體SCARB2或PSGL-1的表達(dá)，使進(jìn)入細(xì)胞的病毒數(shù)增加；PLAC8調(diào)控EV71病毒5’UTR活性，促進(jìn)病毒翻譯；PLAC8抑制宿主細(xì)胞的抗病毒免疫，促進(jìn)病毒增殖。因此，我們首先檢測(cè)了PLAC8對(duì)EV71病毒受體SCARB2和PSGL-1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)PLAC8的過(guò)表達(dá)并未引起EV71受體表

7、達(dá)量的增加。然后將病毒的5’UTR插入到熒光素酶基因的調(diào)控區(qū)，發(fā)現(xiàn)PLAC8未顯著引起熒光素酶的表達(dá)，說(shuō)明PLAC8并不是通過(guò)調(diào)控EV71病毒5’UTR的活性而促進(jìn)病毒基因的復(fù)制和翻譯。隨后對(duì)dsRNA的模式識(shí)別受體TLR3進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PLAC8的過(guò)表達(dá)顯著抑制TLR3及其下游干擾素調(diào)控基因IRF3的表達(dá)。說(shuō)明PLAC8在感染早期對(duì)病毒增殖的促進(jìn)是因?yàn)镻LAC8抑制了宿主的抗病毒免疫應(yīng)答，為病毒的增殖提供了良好的宿主環(huán)境，從而加速病毒

8、的增殖。由于EV71感染產(chǎn)生的病變主要是腦、肺等組織的炎性損傷，因此檢測(cè)了PLAC8過(guò)表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6能力的影響。發(fā)現(xiàn)PLAC8可以顯著促進(jìn)IL-6的表達(dá)。
　　由于輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper cells）的分化平衡在嬰幼兒免疫及抗病毒、炎性反應(yīng)失衡中發(fā)揮了重要作用，因此我們通過(guò)淺表顳靜脈注射PLAC8表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建PLAC8過(guò)表達(dá)小鼠模型，探討EV71感染后對(duì)Th細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)在

9、PLAC8過(guò)表達(dá)小鼠中，EV71感染后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)顯著下調(diào)，IL-6、IL-4、IL-17A和TGF-β的表達(dá)顯著上調(diào)。而IFN-γ是Th1細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子，IL-6和IL-17A是Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子，而IL-4和TGF-β分別是Th2和Treg細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子。因此，PLAC8的過(guò)表達(dá)，抑制Th1細(xì)胞分化，抑制其介導(dǎo)的抗病毒細(xì)胞免疫；促進(jìn)Th2、Th17和Treg細(xì)胞分化，從而促進(jìn)其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和

10、免疫抑制作用。同時(shí)，PLAC8過(guò)表達(dá)小鼠外周血和肺組織中干擾素IFN-γ的下調(diào)和炎癥因子IL-6的上調(diào)也證明了PLAC8的過(guò)表達(dá)抑制了抗病毒免疫應(yīng)答并促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。
　　EV71感染PLAC8過(guò)表達(dá)小鼠后，對(duì)小鼠的腦、肺組織進(jìn)行切片、HE染色觀察病理變化。與對(duì)照小鼠相比，PLAC8過(guò)表達(dá)小鼠肺泡壁增厚、局部肺泡結(jié)構(gòu)消失以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象更明顯；而腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象也更明顯。證明過(guò)表達(dá)PLAC8后，

11、EV71更易感染小鼠產(chǎn)生病變。
　　綜上所述，利用EV71感染小鼠腦組織基因芯片篩選出可能在抗病毒免疫中發(fā)揮作用的PLAC8蛋白。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，PLAC8通過(guò)抑制模式識(shí)別受體TLR3及其下游干擾素調(diào)控基因IRF3的表達(dá)，抑制抗病毒免疫應(yīng)答，為病毒復(fù)制提供良好的宿主環(huán)境，從而促進(jìn)病毒增殖。同時(shí)PLAC8可以促進(jìn)炎癥因子IL-6的表達(dá)。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，PLAC8調(diào)控Th細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子的表達(dá)，抑制IFN-γ的表達(dá)，促進(jìn)IL-6、