中國大陸EV71病毒VP1基因分子進化研究及EV71病毒樣顆粒的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　 自1957年以來,手足口病在世界多個國家爆發(fā)流行,特別是20世紀90年代以來,在亞太地區(qū)流行日益猖獗。2007年以來在中國大陸發(fā)生手足口病爆發(fā)流行,至2010年9月底,累計報告300多萬感染病例,嚴重威脅兒童的身體健康和生命安全。手足口病的病原體主要是小RNA病毒科,腸道病毒屬成員,柯薩奇A組16型(Coxsakie A16,CoxA16)和腸道病毒71型(enterovirus71,EV71)最為常見,其中E

2、V71病毒是導致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和死亡病例的主要病原體。依據(jù)VP1基因核苷酸序列的差異,國內(nèi)外學者將EV71分為A、B、C3個基因型,在中國大陸主要是C型。但對中國大陸EV71的長期進化情況還知之甚少；特別是病毒基因進化和變異與2007年以來中國大陸手足口病疫情之間的關系也沒有得到闡明。因此,本課題收集了1987年到2009年中國大陸EV71代表毒株,分析中國大陸EV71病毒的進化及其與2007年以來手足口疫情之間的關系。
　　

3、目前還沒有有效的疫苗用以EV71的預防,但脊髓灰質(zhì)炎疫苗在控制全球脊髓灰質(zhì)炎病毒傳播中的成功實踐,給EV71疫苗的研制帶來了希望,疫苗的研究是EV71研究領域的一個熱點。目前不同形式的EV71疫苗都處于研發(fā)階段,病毒樣顆粒(Virus Like Particle,VLP)疫苗是一種新型的疫苗,是通過分子生物學技術,表達病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白,這些結(jié)構(gòu)蛋白具有天然的自裝配能力,可形成與真正病毒顆粒相同或相似的空心顆粒,沒有病毒的核酸,不

4、能自主復制,沒有感染性,表面有高密度的病毒抗原,保存了構(gòu)象表位,可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞,有效誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應。本課題在對現(xiàn)有EV71疫苗進行比較研究的基礎上,創(chuàng)新性地選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)制備EV71病毒樣顆粒,并對其免疫原性進行了研究。
　　 研究方法：
　　 1.EV71病毒VP1基因分子進化分析:對2008年廣東省9株EV71病毒的VP1基因進行測序,根據(jù)分離時間和地點從Genban

5、k中篩選了64株參考毒株,包括1987—2009年間從中國大陸和臺灣分離的毒株39株,法國7株,荷蘭7株,馬來西亞3株,澳大利亞3株,新加坡2株,美國2株,韓國1株。甩BioEdit軟件對73株毒株的VP1基因相似性得分進行了計算,用Mega4.0軟件的neighbor-joining方法對73株毒株的VP1基因進行了進化分析。
　　 2.EV71病毒樣顆粒構(gòu)建:選擇屬于C6基因亞型的廣東省2008年第一例死亡病例毒株(Fosh

6、an2008-FJ194964)制備病毒樣顆粒,提取Foshan2008-FJ194964株病毒RNA,RT-PCR擴增P1和3CD基因,分別構(gòu)建EV71 P1基因和pGAPZαA重組質(zhì)粒(P1-pGAPZαA)及3CD基因和pGAPZαA重組質(zhì)粒(3CD-pGAPZαA)；將3CD—pGAPZαA重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到SMD1168酵母細胞,構(gòu)建3CD-pGAPZαA-SMD1168重組菌株；將P1-pGAPZαA電轉(zhuǎn)化至3CD-pGAPZ

7、αA—SMD1168重組菌株,構(gòu)建P1—pGAPZαA-3CD—pGAPZαA-SMD1168重組菌株；表達P1和3CD蛋白,及EV71病毒樣顆粒；用Tricine-SDS-PAGE和Western-blot鑒定P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重組菌株蛋白表達；電鏡觀察EV71病毒樣顆粒,并用Tricine—SDS-PAGE和Western-blot鑒定純化的病毒樣顆粒。
　　 3.EV71病毒樣顆粒

8、免疫原性研究:用制備的EV71病毒樣顆粒免疫小鼠,測定血清中特異性IgG抗體的產(chǎn)生水平,體外中和試驗測定免疫小鼠的中和抗體效價評價體液免疫情況；用VLP刺激小鼠脾細胞進行淋巴細胞增殖試驗測定T細胞增殖情況,并測定受VLP刺激的脾細胞細胞因子分泌水平,了解所制備EV71VLP誘導細胞免疫的效果。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.EV71病毒VP1基因分子進化:通過VP1基因進化樹分析和同源性比較,發(fā)現(xiàn)1987年到2009年間,

9、先后共有C2,C3,C4,C6基因亞型和A基因型EV71病毒在中國大陸流行。在20世紀80年代,中國大陸主要是C2基因亞型流行,接著是C3基因亞型,1998年開始出現(xiàn)C4基因亞型流行,并成為優(yōu)勢毒株；從2002年開始,在中國大陸出現(xiàn)了一種新的C6基因亞型,取代C4基因亞型成為中國大陸EV71的優(yōu)勢毒株。一直以來從加利福尼亞分離的CaliforniaBrCr1970-AF135885毒株是唯一的一株A基因型毒株,但2008年和2009年在

10、安徽和湖北省分離到了A基因型毒株。VP1基因184位蘇氨酸在B基因型保守；167位和282位的門冬氨酸在A基因型保守,240位蘇氨酸和249位纈氨酸在C基因型保守。
　　 2.EV71病毒樣顆粒的制備:擴增了P1基因,3CD基因,并分別與pGAPZαA連接,成功構(gòu)建了P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重組質(zhì)粒,測序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；用電穿孔儀先將3CD-pGAPZαA轉(zhuǎn)入SMD1168表達菌株,得到3CD—pGAP

11、ZαA-SMD1168重組表達菌株,然后再將P1-pGAPZαA轉(zhuǎn)入3CD-pGAPZαA-SMD1168重組表達菌株,得到P1-pGAPZαA-3CD—pGAPZαA—SMD1168重組表達菌株,制備了EV71病毒樣顆粒。用Tricine—SDS—PAGE和Western—blot鑒定表明表達的P1蛋白成功被3CD蛋白酶切成大小分別為39KDa,36KDa和129KDa的VP0,VP1和VP3蛋白。電鏡下觀察看到整齊、均一的、直徑約2

12、0nm的病毒樣顆粒。
　　 3.EV71病毒樣顆粒免疫原性評價:動物實驗結(jié)果表明用VLP免疫的小鼠能產(chǎn)生特異性IgG抗體和中和抗體,第8周滴度達到最高,分別為211和27,16周時仍能保持較高的抗體滴度。脾細胞在VLP的刺激下發(fā)生了明顯增殖,并產(chǎn)生了高水平的IL-2,IL-4和IFN-γ,表明誘導產(chǎn)生了Th1細胞免疫反應和Th2細胞免疫反應。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.1987年到2009年間,先后共有C2,C

13、3,C4,C6基因亞型和A基因型EV71病毒在中國大陸流行,2002年以來在中國大陸出現(xiàn)了一種新的EV71 C6基因型,是2007以來中國大陸的優(yōu)勢毒株,2008年到2009年間在中國大陸重現(xiàn)EV71病毒A基因型的流行。
　　 2.成功構(gòu)建了P1—pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重組質(zhì)粒,兩個重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入同一酵母菌株,形成P1—pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重組菌株,表達了3CD蛋白和P1蛋白