腸道病毒,ev71及coxa16多重pcr檢測(cè)方法的研究

1、<p>　　腸道病毒、EV71及CoxA16多重PCR檢測(cè)方法的研究</p><p>　　倪楠1*，候佩強(qiáng)2，張榮強(qiáng)3，陸娟娟4，韓彬5，孫濤6</p><p>　?。ㄉ綎|泰安市疾病預(yù)防控制中心，泰安 271018）</p><p>　　【摘要】 目的 建立多重聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex polymerase chain reaction）檢測(cè)方

2、法，同時(shí)快速?gòu)氖肿憧诓∪思S便、咽拭子標(biāo)本中檢測(cè)腸道病毒（Pan-enterovirus，PE）、腸道病毒71型（Enterovirs 71 EV71）和柯薩奇病毒A組16型（Coxsachie virus,CoxA16）。 方法 設(shè)計(jì)三對(duì)寡核苷酸引物分別在同一體系中擴(kuò)增腸道病毒（Pan-enterovirus，PE）、腸道病毒71型（Enterovirs 71 EV71）及柯薩奇病毒A組16型（Coxsachie virus,Cox

3、A16）特異性基因片段，優(yōu)化反應(yīng)體系，測(cè)定該方法的靈敏性，并用乙型腦炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型檢測(cè)其特異性。 結(jié)果 對(duì)臨床標(biāo)本多重PCR檢測(cè)中，EV71（﹢）標(biāo)本可見264bp和440bp兩條特異性條帶，CoxA16（﹢）標(biāo)本可見440bp、550bp兩條特異性條帶，PE（﹢）EV71（﹣）CoxA16（﹣）標(biāo)本可見440bp一條特異性條帶。病毒cDNA最低檢出濃度分別為4.78ug/ml、2.36 ug/ml、43.2

4、</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 腸道病毒；EV71；CA16；多重PCR</p><p>　　Study on a multiplex polymerase chain reaction assay for human enterovirus，human enterovirus 71 and coxsackievirus A16</p><p>　　NI Nan

5、1，HOU Pei-qiang2，ZHANG Rong-qiang3, LU Juan-juan4,HAN Bin5,SUN Tao6(Taian Center for Diseases Control and Prevention, Taian 271000, China)</p><p>　　【Absrtact】 Objective To establish a rapid and accurate me

6、thod for the detection of PE, EV71 and CoxA16 from patients with hand foot and mouth disease(HFMD) by multiplex polymerase chain reaction (PCR). Methods Three pairs of Oligonucleotide primers were designed according to

7、the specific sexogene of PE, EV71 and CoxA16 to amplify genetic fragments by multiplex-PCR. The condition of multiplex-PCR was optimized in which sensitivity was determined; specificity was evaluated using Japanese encep

8、h</p><p>　　【Key words】Pan-enterovirus; EV71; CA16; multiplex-PCR</p><p>　　基金項(xiàng)目：泰安市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20103020）</p><p>　　*通訊作者：倪楠。Tel：+86-0538-8241560489832；Fax：+86-0538-8489832；E-mail：niba8

9、3@163.com</p><p>　　作者簡(jiǎn)介：倪楠（1983-），女，山東泰安籍，主要從事病毒檢測(cè)工作</p><p>　　手足口?。╤andfootmouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的傳染病，臨床主要表現(xiàn)為口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹[1-2]，近年來其爆發(fā)呈逐年上升趨勢(shì)，是目前威脅嬰、幼兒及學(xué)齡前兒童的主要傳染病之一。腸道病毒71型（Enterov

10、irs 71 EV71）、柯薩奇病毒A組16型（Coxsachie virus,CoxA16）是手足口病的主要病原[3-5]，如何快速、準(zhǔn)確地從臨床疑似手足口患兒咽拭子及大便標(biāo)本中檢測(cè)其病原，并為流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷提供依據(jù)，已成為疾病預(yù)防控制部門亟待解決的問題。</p><p>　　多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)反應(yīng)體系中，加入多對(duì)特異性引物，可同時(shí)在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出多條目的片段，實(shí)現(xiàn)一次性快速檢測(cè)多種病原微生

11、物的目的。大大節(jié)省了檢測(cè)成本和時(shí)間。本研究通過設(shè)計(jì)特異性多重PCR引物并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了腸道病毒、EV71和CoxA16的多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)，具有敏感、特異、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于手足口病的快速診斷。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p>&

12、lt;p>　　選擇經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PE、EV71和CoxA16陽(yáng)性且病毒分離培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的病例，取這些病例的臨床標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于提取RNA及multiplex-PCR。</p><p><b>　　1.2試劑和儀器</b></p><p>　　實(shí)時(shí)熒光定量定量PCR專用試劑盒（上海碩世生物科技公司），RNA抽提試劑（Roche公司），mu

13、ltiplex-PCR試劑（Invitrogen公司），RD細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，熒光定量PCR儀（ABI7500型，美國(guó)AB公司），低溫高速離心機(jī)3-18K（德國(guó)Sigma公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），PCR擴(kuò)增儀（MJ PTC-200），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-Rad GelDoc XR）。</p><p>　　1.3病毒RNA的提取</p><p>　　將發(fā)生細(xì)胞

14、病變的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用High pure Viral RNA kit，按照操作說明書提取病毒RNA。</p><p><b>　　1.4引物設(shè)計(jì)</b></p><p>　　參照已分離及Genebank相關(guān)病毒株序列，根據(jù)PE 5’UTR保守序列，EV71 VP1基因及CoxA16核酸序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物，見下表。</p><p>　　腸道病毒

15、、腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型PCR引物序列</p><p>　　Primers of PE,EV71 and CoxA16</p><p><b>　　1.5多重PCR</b></p><p><b>　　1.5.1逆轉(zhuǎn)錄</b></p><p>　　2ugRNA加入ddH2O溶至15.5

16、ul于70℃孵育5min,立即置于冰上防止RNA復(fù)性。加入Oligodt(0.5ug/ul)和dNTPs Mixture(10mmol/L)各1 ul、Reconmbinant Rnasin Ribonuclese Inhibitor 25 Uints(40U/ul)、0.5ul M-MLV RT 200U(25ul體系)1ul于37℃孵育60min。</p><p>　　1.5.2多重PCR擴(kuò)增</p&g

17、t;<p>　　采用25ul反應(yīng)體系，其中含2.5mMMgCl2,0.3mMdNTPs,2.5U Taq DNA聚合酶，10-20mM PE引物，20-40Mm EV71引物，20mM CoxA16引物，10ul模版cDNA。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,57℃退火30s，72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。</p><p>　　1.6多重PCR特異性鑒定<

18、/p><p>　　通過B3,B5,C2,C4,C1亞型EV71毒株，CoxA16毒株，乙型腦炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型提取核酸進(jìn)行特異性鑒定。</p><p>　　1.7多重PCR敏感性鑒定</p><p>　　陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)株標(biāo)本提取的病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，10 倍稀釋至10－6濃度，每個(gè)濃度各取3 μl作為模板，按照上述多重PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行

19、擴(kuò)增，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，核酸測(cè)定儀紫外分光光度法測(cè)定3 種病毒cDNA 的最低檢出濃度。</p><p>　　1.8多重PCR產(chǎn)物鑒定</p><p>　　將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上水平電泳，90 伏恒流電泳30 min， 凝膠成像儀紫外觀察照相。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　

20、　2.1多重PCR檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　多重PCR對(duì)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PE、EV71和CoxA16陽(yáng)性且病毒分離培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與病毒分離、實(shí)時(shí)熒光定量PCR一致,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見下圖。</p><p>　　多重PCR對(duì)感染細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果電泳圖</p><p>　　Gel electrophoresis of multiple-PC

21、R products from infected cell</p><p>　　M：DL2000 DNA Marker; Lane 1 – specimen positive for enterovirus (unknown serotype); Lanes 2 and 3 – specimens positive for CoxA16; Lanes 4 and 5 – specimens positive fo

22、r EV71; Lane 6 – negative control; Lane 7 – positive control (a mixture of infected EV71- and CoxA16-infected cell RNA templates). Pan-enterovirus RT-PCR amplicon size – 440 bp; EV71-specific RT-PCR amplicon size –

23、264 bp; CoxA16-specific RT-PCR amplicon – 550 bp.</p><p>　　2.2多重PCR特異性檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　選取經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增為EV71（﹢）、CoxA16（﹢）及PE（﹢）EV71（﹣）CoxA16（﹣）的糞便標(biāo)本各20份，提取病毒RNA、多重PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，所有EV71（﹢）標(biāo)本可

24、見264bp和440bp兩條特異性條帶，CoxA16（﹢）標(biāo)本可見440bp、550bp兩條特異性條帶，PE（﹢）EV71（﹣）CoxA16（﹣）標(biāo)本可見440bp一條特異性條帶。乙型腦炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型提取核酸進(jìn)行同體系、同條件多重PCR擴(kuò)增未見特異性條帶。</p><p>　　2.3多重PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　在相同條件下所設(shè)計(jì)的多種PCR能檢測(cè)出

25、PE、EV71、 CoxA16 cDNA最高稀釋倍數(shù)分別為10-5、10-5、10-4，用紫外分光光度法測(cè)定的多重PCR檢測(cè)的cDNA最低檢出濃度分別為4.78ug/ml、2.36 ug/ml、43.27 ug/ml。</p><p><b>　　3.討論</b></p><p>　　HFMD是全球性傳染病，以嬰幼兒和低齡兒童感染為主[6]，該病傳染性強(qiáng)、傳播速度快、

26、傳播途徑復(fù)雜，短時(shí)間內(nèi)可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。因此，早期的快速檢測(cè)和及時(shí)的診斷對(duì)本病的防治和預(yù)后尤為重要。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離、血清學(xué)抗體檢測(cè)、RT-PCR、Real-time PCR等。但細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)雜耗時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)又常常受腸道病毒交叉反應(yīng)的影響，兩者均不適合早期應(yīng)急診斷。RT-PCR技術(shù)是目前最為快速有效的檢測(cè)方法之一，但其需要腸道病毒通用引物鑒定后再進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)，無法做到簡(jiǎn)便快速。Real-tim

27、e PCR從敏感性、特異性與速度上都具有一定優(yōu)勢(shì)，但是檢測(cè)成本較高。多重PCR原理與普通PCR相同，只是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異的引物，如果存在于各引物對(duì)特異互補(bǔ)的模板，則可同時(shí)在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增出多條目的DNA片段。多重PCR在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病毒或?qū)Χ鄠€(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增分析，大大節(jié)省了時(shí)間和試劑，簡(jiǎn)便高效，為疾病監(jiān)測(cè)提供了更多更準(zhǔn)確的信息。

28、 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　1周世力，楊帆, 金奇, 等. 腸道病毒71型的研究進(jìn)展. 病毒學(xué)報(bào),2003,19(3):284-286.</p><p>　　2 陸一涵, 姜慶五人腸道病毒71型與手足口病. 疾病控制雜志,2008,12(3):183-188.</

29、p><p>　　3 李文先, 葉冬青. EV71病毒感染并發(fā)神經(jīng)源性肺水腫研究進(jìn)展[J].疾病控制雜志,2008,12(3):1882192.</p><p>　　4 卜戈, 郭玲, 李治悅, 等. 阜陽(yáng)市手足口病病例巢式RT-PCR診斷與結(jié)果分析. 中華疾病控制雜志,2009,13(2):111-114.</p><p>　　5 楊洪, 姚相杰, 何雅青, 等. 2

30、008年深圳市36起手足口病疫情的病原學(xué)檢測(cè). 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(10):2328-2329.</p><p>　　6 馬超鋒, 鄭海潮, 鄧惠玲, 等. 2009年西安地區(qū)手足口病病原血清型分析及腸道病毒71型基因特征. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,31(5):603-607.</p><p>　　7 王松, 許誠(chéng), 張紅梅, 等. RT-PCR檢測(cè)手足口病病原

31、體EV71. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志:電子版,2008,2(4):18-19.</p><p>　　8 楊秀惠, 何家鑫, 嚴(yán)延生, 等. 一起手足口病暴發(fā)的病原學(xué)診斷與分析. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(4)323-325.</p><p>　　9 Ooi MH, Wong SC, Podin Y, et al. Human cnterovius 71 disease in

32、Sarawak, Malaysia a prospective clinical virological and molecular epidem iological study. Clin infect Dis,2007,44(5):646-656.</p><p>　　10 Tu PV, Thao NT, Perera D, et al. Epiden iologic and virologec invest

33、igation of hand foot and mouth disease, southem Vietnam, 2005. Emerg Infect Dis,2007,13(11):1733-1741.</p><p>　　11 Ho M, Chen ER, Hsu KH, et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan. New Engl J