EV71型腸道病毒抗體的制備與鑒定.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus type71，EV71)是小型RNA病毒科腸道病毒屬成員，其感染性強(qiáng)、致病率高，是導(dǎo)致手足口病的主要病原，同時(shí)能引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。由于腸道病毒屬成員數(shù)量多、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性相似，導(dǎo)致其臨床診斷和分類(lèi)鑒定難度加大。目前針對(duì)腸道病毒71型感染多采用抗生素進(jìn)行治療，但是在當(dāng)前病毒耐藥性不斷增加的情況下，尋找一種更安全、更高效的治療特效藥及診斷方法成為一個(gè)急需解決的問(wèn)題。
　　 本論文

2、實(shí)驗(yàn)：(1)制備特異性抗腸道病毒71型卵黃抗體，然后通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫雙向瓊脂擴(kuò)散、Western blot、體外病毒中和實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)其生物活性進(jìn)行鑒定；(2)通過(guò)建立陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株及體內(nèi)誘生腹水法制備了大量抗腸道病毒71型VP1蛋白單克隆抗體，辛酸硫酸銨沉淀法純化后通過(guò)SDS-PAGE電泳和紫外分光光度法鑒定抗體純度和含量，間接ELISA法測(cè)定其中和效價(jià)，鼠單抗業(yè)型分型試紙鑒定其I

3、g類(lèi)與業(yè)類(lèi)；(3)利用偶聯(lián)劑EDC和Sulfo－NHS將腸道病毒71型VP1蛋白單克隆抗體偶聯(lián)到聚丙烯酸修飾的水溶性核量子點(diǎn)上，并利用酶聯(lián)免疫法、熒光發(fā)射光譜、高性能生物質(zhì)譜等分析方法對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用卵黃抗體為捕獲抗體，量子點(diǎn)標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了量子點(diǎn)標(biāo)記免疫熒光檢測(cè)EV71病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)得卵黃中IgY得率達(dá)7.76 mg/mL，SDS-PAGE凝膠電泳

4、測(cè)得IgY抗體的純度為94.86％。初免10d后蛋黃中可檢測(cè)到特異性抗EV71IgY抗體，初免40天后ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)最高1:20480，雙向瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)效價(jià)達(dá)1:16。Western blot分析提取的IgY抗體具有良好的免疫反應(yīng)性，能與EV71特異性結(jié)合；同時(shí)制備的特異性抗EV71 IgY具有良好的體外中和活性，最低中和溶度為7.9ug/mL，中和效價(jià)為1:128。(2)初步篩選到2株抗腸道病毒71型VP1蛋白的細(xì)胞株，效價(jià)

5、均達(dá)到了106以上；腹水純化后經(jīng)還原性SDS-PAGE電泳可見(jiàn)兩條清晰的IgG重輕鏈，紫外分光光度法測(cè)純化前后蛋白濃度分別為為39.28 mg/mL和5.6 mg/mL。經(jīng)鼠單抗亞型分型試紙鑒定獲得的單抗類(lèi)型為IgG2b類(lèi)，輕鏈為κ鏈。(3)由酶聯(lián)免疫法及紫外透射反射觀察結(jié)果可知QDS-MAb同時(shí)擁有MAb的生物活性及QDS的化學(xué)發(fā)光特性。熒光光譜圖中QDS-MAb熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移4nm及質(zhì)譜圖中QDS-MAb的分子離子峰比MAb分