腸道病毒71型感染人腸道細(xì)胞的入侵機(jī)制研究.pdf

1、人類腸道病毒71型(EV71)為單正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是引起手足口病的主要病原體，兒童為主要感染人群。臨床癥狀以發(fā)熱以及口腔、手、足部的潰瘍或斑疹為主，隨著病情發(fā)展，可導(dǎo)致肺水腫甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患。目前尚無(wú)有效的治療措施，揭示影響病毒感染的宿主因子，將有助于抗病毒藥物的研發(fā)。
　　一般病毒感染宿主細(xì)胞需經(jīng)過(guò)吸附、入侵、脫殼、基因組和蛋白質(zhì)合成、裝配、釋放這一完整的復(fù)制周期。其中，吸附和內(nèi)吞是病毒侵入細(xì)胞

2、的首要環(huán)節(jié)，病毒通常利用細(xì)胞膜上的受體和細(xì)胞自身固有的內(nèi)吞途徑侵入宿主細(xì)胞。P選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）和B族Ⅱ型清道夫受體2(SCARB2)是EV71的兩個(gè)功能性受體。病毒與受體結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;啟動(dòng)病毒的細(xì)胞入侵事件。病毒的細(xì)胞入侵途徑具有多樣性，病毒通常可以利用多種內(nèi)吞途徑侵入不同的甚至同一種靶細(xì)胞，其中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑最為常見(jiàn)。此外，也有病毒依賴非網(wǎng)格蛋白或非小窩蛋白

3、介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)行細(xì)胞入侵。
　　EV71的傳播以糞-口途徑最廣，在此傳播途徑中，腸道是人體抵御病原體的第一道屏障。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EV71經(jīng)口腔接種小鼠后，最先在小腸組織表現(xiàn)出病原體陽(yáng)性。因此，EV71很可能首先通過(guò)對(duì)腸道系統(tǒng)進(jìn)行感染，在小腸道細(xì)胞內(nèi)大量快速?gòu)?fù)制，隨后入血導(dǎo)致病毒血癥并引發(fā)其它器官的感染。目前，關(guān)于EV71感染人腸道細(xì)胞的入侵機(jī)制尚不清楚。
　　本課題旨在探明EV71如何利用細(xì)胞的固有元件入侵人腸道細(xì)胞，

4、以及病毒入侵是否會(huì)增加人腸道上皮細(xì)胞的通透性、是否會(huì)破壞細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)。選用人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2作為EV71感染的靶細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及小RNA干擾等技術(shù)，進(jìn)行病毒受體的鑒定。利用人膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的小干擾RNA文庫(kù)，對(duì)影響病毒感染的關(guān)鍵宿主因子進(jìn)行高通量篩選。結(jié)合篩選結(jié)果，采用小RNA干擾、化學(xué)抑制劑作用和過(guò)表達(dá)顯性抑制突變體等方法，確定EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的入侵機(jī)制和入侵相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時(shí)，建立C

5、aco-2細(xì)胞單層體外培養(yǎng)模型，模擬小腸刷狀緣上皮結(jié)構(gòu)，探索EV71病毒入侵對(duì)腸上皮細(xì)胞通透性及緊密連接結(jié)構(gòu)的影響。
　　一、SCARB2是EV71感染Caco-2細(xì)胞的功能性受體
　　人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞）和人急性白血病單核細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）分別作為SCARB2和PSGL-1表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡技術(shù)對(duì)SCARB2和PSGL-1在Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PSG

6、L-1基本不表達(dá);而SCARB2高表達(dá)，其在Caco-2細(xì)胞表達(dá)水平與在RD細(xì)胞中相當(dāng)。進(jìn)一步利用小干擾RNA下調(diào)SCARB2的蛋白表達(dá)水平后， EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵被明顯抑制。以上結(jié)果表明，SCARB2是EV71感染Caco-2細(xì)胞的功能性受體。
　　二、EV71感染Caco-2細(xì)胞依賴的膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子的篩選
　　利用小干擾RNA文庫(kù)，靶向下調(diào)140個(gè)人膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子的表達(dá)，然后進(jìn)行病毒感染。通過(guò)免疫熒光、圖

7、像分析及統(tǒng)計(jì)技術(shù)，分析各靶分子的下調(diào)對(duì)EV71的感染性的影響。結(jié)果顯示，其中20個(gè)宿主因子的下調(diào)，對(duì)EV71感染抑制率達(dá)50％以上，這些宿主因子包括:DNM2、HGS、TSG101、VPS4A、VPS36、PIK3CG、BECN1、ARPC5、ENTH、EPN2、AP281、COPA、GAF1、GIT1、VAPB、VCP、NSF、RAB3D、RAB7B、RAB7L1。
　　三、EV71感染Caco-2細(xì)胞不依賴網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介

8、導(dǎo)的內(nèi)吞途徑
　　下調(diào)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑的幾個(gè)關(guān)鍵分子CLTA、CLTB、CLTC和AP2A1后，并不能抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染。通過(guò)網(wǎng)格蛋白抑制劑chlorpromazine作用、細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)EPS15蛋白顯性抑制突變體(EPS15 DN)阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑后，也并不能抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染。同樣，敲低小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子CAV1、CAV2和CAV3，并不影響EV71對(duì)Caco-

9、2細(xì)胞的感染。通過(guò)使用化學(xué)抑制劑filipinⅢ和caveolin-1蛋白顯性抑制突變體(CAV1 DN)阻斷小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑后，也并不影響病毒對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染性。以上結(jié)果表明，EV71感染Caco-2細(xì)胞不依賴網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。
　　四、EV71感染和入侵Caco-2細(xì)胞對(duì)化學(xué)抑制劑EIPA敏感，但并不依賴巨胞飲途徑
　　利用鈉氫泵抑制劑EIPA阻斷宿主細(xì)胞巨胞飲途徑后，可抑制EV71對(duì)Cac

10、o-2細(xì)胞的感染和入侵。而下調(diào)其它幾個(gè)參與巨胞飲的關(guān)鍵分子CDC42、RAC1、PKC和PAK1的表達(dá)，卻并不影響病毒的感染性;Caco-2細(xì)胞經(jīng)RAC1抑制劑NSC23766、PAK-1抑制劑IPA-3和PKC抑制劑bisindolylmaleimide處理后，病毒對(duì)細(xì)胞的感染性也未被明顯抑制。結(jié)果表明，雖然EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵對(duì)EIPA敏感，但巨胞飲途徑并不是病毒的入侵途徑。
　　五、發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin

11、2)在EV71入侵Caco-2細(xì)胞過(guò)程中至關(guān)重要
　　利用小干擾RNA下調(diào)發(fā)動(dòng)蛋白（Dynamin2，DNM2）的表達(dá)，可顯著抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵。通過(guò)dynamin2抑制劑dynasore作用及過(guò)表達(dá)dynamin2蛋白顯性抑制突變體(DNM2 DN)抑制dynamin2的功能后，可明顯抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵。在病毒感染入侵不同時(shí)間點(diǎn)，利用dynasore對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)EV7

12、1感染抑制作用主要發(fā)生在病毒入侵早期階段。結(jié)果表明，dynamin2對(duì)于EV71內(nèi)吞入胞過(guò)程至關(guān)重要，其主要在病毒入侵早期階段發(fā)揮作用。
　　六、EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵需要膽固醇參與
　　膽固醇剔除劑MβCD對(duì)Caco-2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，明顯抑制了EV71對(duì)靶細(xì)胞的感染與入侵。將一定濃度的膽固醇添加到經(jīng)MβCD預(yù)處理過(guò)的Caco-2細(xì)胞，另細(xì)胞膽固醇回到生理水平后，又可恢復(fù)EV71與EV71假病毒的感染性。

13、在病毒感染入侵不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)MβCD處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)EV71感染抑制作用主要發(fā)生在病毒入侵早期階段。結(jié)果表明，膽固醇參與了EV71感染與入侵Caco-2細(xì)胞，且主要在病毒入侵早期階段發(fā)揮作用。
　　七、EV71入侵Caco-2細(xì)胞依賴轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物相關(guān)因子HGS、VPS36、VPS37A、 VPS37C、 CHMP2A、 VPS4A
　　利用小干擾RNA下調(diào)Caco-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物(Endosom

14、al sortingcomplex required for transport，ESCRT)相關(guān)因子HGS、VPS36、VPS37A、VPS37C、CHMP2A和VPS4A的表達(dá)，可顯著抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染與入侵，提示ESCRT在EV71入侵Caco-2細(xì)胞過(guò)程中起作用。1，2-棕櫚酰磷酯酰肌醇-3-磷酸（Phosphatidylinositol3-phosphate，PI3P）對(duì)于ESCRT在內(nèi)體膜上的定位和多囊泡體

15、(Multivesicular bodies，MVB)的形成非常重要，其產(chǎn)生主要由磷脂酰肌醇激酶PIK3CG催化介導(dǎo)。進(jìn)一步通過(guò)小干擾RNA下調(diào)PIK3CG的表達(dá)、利用化學(xué)抑制劑wortmannin抑制PIK3CG活性后，發(fā)現(xiàn)EV71對(duì)靶細(xì)胞的感染與入侵均被明顯阻斷。結(jié)果表明，EV71入侵Caco-2細(xì)胞依賴ESCRT，在其參與下，病毒很可能隨之被遞呈至MVB。
　　八、蛋白激酶A(PKA)與蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在EV71入

16、侵Caco-2細(xì)胞階段發(fā)揮重要作用
　　通過(guò)多種靶向細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的化學(xué)抑制劑對(duì)Caco-2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)H-89（PKA抑制劑）和NSC-87877（SHP-2抑制劑）可以明顯抑制EV71的感染與入侵，且高濃度的NSC-87877基本可以完全阻斷病毒的感染與入侵。在病毒感染入侵不同時(shí)間點(diǎn)用H-89或NSC-87877處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)H-89主要在病毒感染起始階段表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而NSC-87877僅在入侵中、晚期

17、階段發(fā)揮抑制功能。以上結(jié)果提示，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子PKA和SHP-2對(duì)于EV71入侵Caco-2細(xì)胞至關(guān)重要，且PKA主要在病毒感染起始階段起作用;而在病毒入侵中、晚期階段，SHP-2發(fā)揮著決定性作用，其發(fā)揮作用的靶點(diǎn)很可能是在病毒的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)或脫殼階段。
　　九、EV71入侵可改變緊密連接結(jié)構(gòu)進(jìn)而增加Caco-2細(xì)胞單層通透性
　　利用transwell培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞單層跨膜電阻值(TEER)

18、及細(xì)胞間緊密連接對(duì)細(xì)胞單層的完整性進(jìn)行評(píng)估。將EV71病毒加入Caco-2細(xì)胞單層持續(xù)感染2h，檢測(cè)TEER值的變化，利用免疫熒光對(duì)ZO-1進(jìn)行染色，確定緊密連接是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞單層跨膜電阻值TEER降低了50％以上，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，呈非連續(xù)性分布，提示EV71對(duì)分化成熟的Caco-2細(xì)胞單層進(jìn)行入侵時(shí)，可造成緊密連接的改變，進(jìn)而增加細(xì)胞單層通透性。
　　本課題初步闡明了EV71入侵人腸道細(xì)胞的分子與細(xì)胞機(jī)