腸道病毒分子流行病學(xué)及腸道病毒71型感染致炎癥反應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是導(dǎo)致手足口病重癥病例的重要病原體之一，具有明顯的嗜神經(jīng)性，可導(dǎo)致腦炎、腦干腦炎、無菌性腦膜炎、腦脊髓炎、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)病變。EV71于1969年首次在美國加州患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新生兒糞便標(biāo)本中分離出來，此后在歐亞國家及我國全國范圍內(nèi)廣泛流行，累及我國各省、市和自治區(qū)。規(guī)模較大、較為嚴(yán)重的一次為1998年在臺(tái)灣爆發(fā)的EV71流行，在該次流行中，共有405例重癥患兒，其中78例死亡，死亡率占重癥患者

2、的19.2％。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，2012年，全國手足口病患病人數(shù)已達(dá)到2168737人，死亡567人。其死亡原因主要由于EV71感染引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致肺水腫、心肌炎等并發(fā)癥，但其致炎癥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制目前還不明確。在治療方面，尚缺乏特異、高效的抗病毒藥物，抑制炎癥反應(yīng)和對(duì)癥治療是主要治療措施。在EV71感染的臨床治療中，糖皮質(zhì)激素常被用于抑制神經(jīng)的炎癥反應(yīng)，但其對(duì)機(jī)體全身性的免疫抑制，具有較大的毒副作用并可導(dǎo)致病毒感染擴(kuò)散，易引起繼

3、發(fā)性細(xì)菌感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，為應(yīng)對(duì)EV71的流行及降低死亡率，充分認(rèn)識(shí)EV71感染導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)機(jī)制顯得極為重要。
　　利用流行病學(xué)和分子流行病學(xué)對(duì)河南無菌性腦膜炎疫情和山東臨沂手足口病疫情進(jìn)行分析。引起河南無菌性腦膜炎疫情的病原體為柯薩奇B5病毒，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示該病毒屬于E亞型，重癥分離株在進(jìn)化上形成一單獨(dú)分支，VP1區(qū)95位點(diǎn)氨基酸可能為CVB5病毒重要的毒力決定簇。引起山東臨沂手足口病疫情的病原體為腸道病毒7

4、1型，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示該病毒屬于C4亞型，此次疫情毒株由3條傳播鏈進(jìn)行傳播，重癥分離株與輕癥分離株在VP1區(qū)145位氨基酸差異顯著，說明該位點(diǎn)可能為EV71病毒重要的毒力決定簇。腸道病毒引起的手足口病在國內(nèi)廣泛流行，對(duì)嬰幼兒的身體健康帶來嚴(yán)重威脅。通過對(duì)腸道病毒流行的大量監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)基因變異促進(jìn)了病毒毒力增強(qiáng)，從而加重了感染所引起的癥狀。然而，EV71致病機(jī)制目前尚不十分清楚，致病機(jī)制研究還處于摸索階段。EV71在國內(nèi)流行主要以C4亞

5、型為主，而C4亞型對(duì)動(dòng)物敏感性低，感染動(dòng)物模型極不易構(gòu)建，為研究C4亞型的致病機(jī)制帶來了阻礙。為應(yīng)對(duì)國內(nèi)EV71感染的嚴(yán)峻形勢，我們利用EV71 C4亞型毒株(AH08/06)建立感染小鼠致炎癥反應(yīng)模型，以此來研究EV71感染致炎機(jī)制，為有效控制EV71感染，開發(fā)特異性抗病毒藥物和疫苗開拓新思路。
　　首先，我們對(duì)EV71感染小鼠模型生存、體征情況進(jìn)行觀察。腹腔注射EV71病毒(10-7TCID50)感染1日齡昆明小鼠，小鼠感染后

6、會(huì)出現(xiàn)消瘦、震顫、頸部僵硬、抽搐、肢體癱瘓等典型發(fā)病癥狀。感染組小鼠從第4天開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，第6天全部死亡。感染組從第2天開始，體重增長趨于平緩，直到第6天全部死亡為止，感染組第3-6天體重顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。感染組小鼠從第3天開始活動(dòng)力明顯降低，第4天出現(xiàn)后肢癱瘓，第6天不能活動(dòng)、無法進(jìn)食、呼吸衰竭。感染后3-6天出現(xiàn)定向障礙。沒有出現(xiàn)皮膚出疹的情況。從生存率上可以看出AH08/06株對(duì)小鼠極為敏感，屬于鼠適應(yīng)株。在

7、體征上，本模型基本符合人感染EV71重癥癥狀，適合進(jìn)一步開展致病機(jī)制研究。
　　為了解小鼠體內(nèi)感染EV71的分布情況以及EV71在體內(nèi)的傳播方式，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR、組織病毒滴度測定、免疫組織化學(xué)等技術(shù)手段對(duì)EV71感染小鼠1-6天的血、腦、肺、小腸、后肢肌肉、肝、脾、腎等組織器官病毒時(shí)空分布進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，在時(shí)間順序上，小鼠感染1天后僅在血中檢測到病毒，小腸、肺、骨骼肌、脊髓在感染2天后可檢測到病毒，腦是最后檢測出病毒的

8、組織，肝、腎、脾均沒有發(fā)現(xiàn)病毒感染。在感染病毒累積量上，血液在整個(gè)感染過程中病毒滴度比較平緩，說明感染造成了持續(xù)的病毒血癥;骨骼肌內(nèi)病毒滴度明顯高于其它組織，說明骨骼肌是EV71復(fù)制的最主要靶器官;腦和脊髓感染的病毒量僅次于骨骼肌，也是EV71攻擊的主要靶器官，另外，免疫組化結(jié)果顯示，EV71在中樞神經(jīng)系統(tǒng)僅感染腦干和脊髓的神經(jīng)元;小腸和肺感染量最低。根據(jù)以上結(jié)果，我們可以推測出EV71在體內(nèi)以兩種方式進(jìn)行傳播:首先，病毒進(jìn)入腹腔后，可

9、能通過淋巴組織迅速進(jìn)入血液，同時(shí)感染小腸，隨后病毒隨血液傳播到骨骼肌、肺等靶組織感染并在其內(nèi)復(fù)制。其次，在感染時(shí)間上脊髓要先于腦，而腦的感染時(shí)間要滯后于其它組織器官，同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示EV71感染腦部僅能感染腦干部位，這說明EV71進(jìn)入腦是從脊髓傳播而來，因此EV71進(jìn)入腦部可能是按照從外周神經(jīng)到脊髓再到腦的神經(jīng)通路進(jìn)行傳播。
　　為了解EV71感染對(duì)組織的損傷程度，我們利用HE染色對(duì)EV71感染小鼠各器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。E

10、V71感染小鼠腦部僅腦干檢測到病毒感染，腦干受損傷神經(jīng)元附近出現(xiàn)大量的單核細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，多發(fā)性增生的膠質(zhì)細(xì)胞聚集形成膠質(zhì)小結(jié);部分神經(jīng)元顯著腫脹、變性、壞死，噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象明顯;小血管周圍出現(xiàn)袖套樣炎性細(xì)胞浸潤，以單核、淋巴細(xì)胞為主及少量中性粒細(xì)胞，說明腦干發(fā)生了劇烈的炎癥反應(yīng)。骨骼肌內(nèi)發(fā)生明顯的肌纖維斷裂，出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞，造成嚴(yán)重的壞死性肌炎。小腸感染后并沒有發(fā)生明顯的病理變化，說明小腸對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的耐受作用要明顯大于其它組織。

11、心臟出現(xiàn)灶性收縮帶壞死，血管淤血、部分管腔單核、淋巴細(xì)胞比例增高。肺部支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增寬伴數(shù)量不等的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，部分肺泡不張、實(shí)變，或肺泡腔見較多巨噬細(xì)胞及多核巨細(xì)胞。肝臟局部出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤細(xì)胞。脾中性粒細(xì)胞浸潤，脾竇淤血。腎小球附近及腎盂出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。以上結(jié)果顯示，腦干、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重，EV71嗜神經(jīng)現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)嚴(yán)重的腦干腦炎和腦脊髓炎，與人感染EV71死亡病例腦干炎癥損傷

12、情況極為相似，因此這可能成為EV71感染小鼠致死的最主要原因。骨骼肌、肺、肝、脾、腎等多器官系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加速了感染小鼠的死亡。
　　為了解EV71感染對(duì)器官功能的損傷程度，我們對(duì)EV71感染小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等肝腎功能指標(biāo)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)ALT、AST、BUN在感染末期發(fā)生明顯改變，說明在感染后期肝腎功能發(fā)生異常。組織病毒檢測并沒有在肝腎發(fā)現(xiàn)EV71感染

13、，但病理學(xué)檢查顯示肝腎在感染后期均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致肝腎功能發(fā)生異常。因此，可以推測肝腎損傷可能由神經(jīng)或免疫調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致，同時(shí)肝腎功能失調(diào)也會(huì)加速感染小鼠的死亡，這將有助于我們進(jìn)一步了解EV71感染引起的神經(jīng)和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　為研究EV71感染小鼠炎癥發(fā)生機(jī)制，我們對(duì)EV71感染小鼠血清31種細(xì)胞因子進(jìn)行流氏細(xì)胞測定，發(fā)現(xiàn)G-CSF、IL-1α、IL-6、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1β、RANTES、

14、IFN-γ、TNF-α等10種因子在EV71感染過程中發(fā)生明顯變化，說明EV71感染引起體內(nèi)細(xì)胞因子風(fēng)暴產(chǎn)生。細(xì)胞因子在抗病毒反應(yīng)、參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫方面具有重要作用。IL-6、IFN-γ、 IP-10、MIP-1β和TNF-α是參與炎癥反應(yīng)主要因子，其水平大幅升高，說明EV71感染小鼠體內(nèi)發(fā)生劇烈炎癥反應(yīng)，同時(shí)這些因子已成為預(yù)測EV71感染重癥的標(biāo)志檢測物。細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生不僅能保護(hù)機(jī)體防御病毒入侵，還能嚴(yán)重地影響了機(jī)體的免疫耐

15、受作用，也是引起EV71重癥、死亡病例的重要原因。因此，EV71感染小鼠細(xì)胞因子變化水平，進(jìn)一步闡明了機(jī)體在EV71感染過程中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)降低EV71感染重癥患者的病死率有重要意義。
　　綜合國內(nèi)外研究結(jié)果以及我們動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腦部炎性損傷是EV71感染重癥及死亡的主要原因。因此，我們重點(diǎn)關(guān)注EV71感染小鼠腦部炎性損傷機(jī)制。而補(bǔ)體系統(tǒng)是炎癥反應(yīng)發(fā)生的中心，在H1N1流感等病毒的致炎機(jī)制中起關(guān)鍵作用。因此，本研究也重點(diǎn)關(guān)注補(bǔ)

16、體系統(tǒng)在EV71腦部炎性損傷中所起的作用。通過對(duì)補(bǔ)體C3d蛋白免疫組化分析顯示，EV71感染小鼠腦干和肌肉炎癥反應(yīng)發(fā)生部位部位出現(xiàn)C3d沉積，這表明補(bǔ)體系統(tǒng)激活。Western blot結(jié)果顯示，腦部補(bǔ)體C3d蛋白在感染前期和后期大量表達(dá)，推測補(bǔ)體系統(tǒng)以兩種不同激活途徑參與抗病毒和炎癥反應(yīng)。補(bǔ)體抑制因子DAF和CD59mRNA表達(dá)量由前期升高迅速轉(zhuǎn)為下降，表明在EV71感染小鼠過程，補(bǔ)體系統(tǒng)在感染前期參與了抗病毒反應(yīng)和趨化炎癥因子反應(yīng)，

17、而后期補(bǔ)體系統(tǒng)由于補(bǔ)體調(diào)控分子的抑制作用下降，直接導(dǎo)致機(jī)體的耐受力下降，結(jié)合補(bǔ)體大量激活，從而加劇了炎癥反應(yīng)的程度，其產(chǎn)生的MAC也對(duì)機(jī)體正常組織產(chǎn)生傷害。由此，我們可以推測，補(bǔ)體在EV71感染至炎癥反應(yīng)和機(jī)體耐受力方面可能起到了至關(guān)重要的作用。
　　有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫調(diào)節(jié)方面起重要的調(diào)控作用。在分子水平上，我們對(duì)miRNA對(duì)EV71感染小鼠致腦部炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究。利用miRNA芯片對(duì)EV71感

18、染3天和6天的小鼠miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了檢測。在EV71感染小鼠腦中共檢測出398條microRNA。感染3天的microRNA表達(dá)譜明顯不同于感染6天。感染3天與對(duì)照3天microRNA表達(dá)差異不明顯，而感染6天與對(duì)照6天的microRNA表達(dá)出現(xiàn)較大差異。因此，在EV71感染小鼠過程中，microRNA表達(dá)隨時(shí)間變化。EV71感染后3天，感染組僅有2個(gè)miRNA發(fā)生下調(diào)，而感染后6天，感染組有38個(gè)miRNA發(fā)生下調(diào)，22個(gè)miRN

19、A發(fā)生上調(diào)。這表明EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中，miRNA發(fā)揮了調(diào)控作用。對(duì)差異表達(dá)miRNA預(yù)測靶標(biāo)進(jìn)行GO分析和pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA對(duì)軸突導(dǎo)向通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、神經(jīng)生長因子通路等神經(jīng)活動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)途徑調(diào)控作用明顯，這表明腦內(nèi)miRNA參與了EV71感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控，為深入了解EV71感染致炎機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。
　　綜合上述研究內(nèi)容，本研究對(duì)腸道病毒感染引起

20、的疫情進(jìn)行流行病學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查，分析腸道病毒基因的變異進(jìn)化規(guī)律，為手足口病防控提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過EV71感染致炎癥反應(yīng)小鼠模型，確定EV71可感染腦、脊髓、骨骼肌、肺、小腸等多組織器官并造成炎癥反應(yīng)和功能障礙，推斷EV71在小鼠體內(nèi)可能通過血液和神經(jīng)兩種途徑進(jìn)行傳播，細(xì)胞因子和補(bǔ)體在炎癥反應(yīng)和機(jī)體耐受方面起重要作用，并在分子水平上初步確定miRNA參與了EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。本研究為EV71感染小鼠致炎