人類腸道病毒A組山東地方株的基因型分布及其所致疾病分子流行病學研究.pdf

1、背景：人類腸道病毒(Human Enterovirus，HEV)屬于微小核糖核酸病毒科（Picornavirdae）腸道病毒（Enterovirus）屬，是一類在人類腸道繁殖的常見病毒。HEV通常以無癥狀的隱性感染為主，病人和無癥狀帶毒者為其主要的傳染源，主要通過分泌物或排泄物及其污染的物品而經(jīng)糞-口、日常接觸、空氣飛沫等途徑傳播，對易感人群具有高度的感染性，兒童是最敏感的人群，受感染后可獲得免疫力。HEV在人體腸道中增殖，但很少引起腹

2、瀉等消化道癥狀，是以消化道為原發(fā)灶的全身感染，感染過程中形成病毒血癥，在臨床上可引起多種疾病，如急性弛緩性麻痹(Acute Flaccid Paralysis，AFP)、腦膜炎或腦炎、心肌炎、急性出血性結(jié)膜炎、手足口?。℉and，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD）、類感冒病癥等。近年來，由HEV引起的各種疾病的發(fā)生率一直呈明顯上升趨勢。傳統(tǒng)上根據(jù)病毒在人或靈長類動物來源細胞上的復制能力，在不同動物種類上的感染性、致

3、病性和抗原差異性，將HEV按血清型分為脊髓灰質(zhì)類（以下簡稱脊灰）病毒（Poliovirus，PV1-3型）、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A型(CVA1-22和24型)、柯薩奇病毒B型（CVB1-6型）、埃可病毒(Echovirus，ECHO1-7、9、11-27、29-33型)。隨著分子生物學技術(shù)與生物信息學技術(shù)的應(yīng)用，根據(jù)生物學及遺傳特性，HEV被重新劃分為A、B、C、D共4個基因組，其中HEV-A包括17個基因型，即C

4、VA2-8、10、12、14、16、腸道病毒71型(EV71)、EV76、EV89-92。HEV病毒的基因組為單股正鏈RNA，長約7.5kb，起mRNA作用，整個基因組只含有一個開放閱讀框架（Open Reading Frame，ORF），編碼多聚蛋白(Polyprotein)，最后產(chǎn)生4個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白中的VP1蛋白是最主要的衣殼蛋白，是HEV與宿主細胞上受體進行識別、結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)，許多重要的血

5、清型特異性中和位點位于其上；它不但與病毒的抗原性有關(guān)，而且位于病毒顆粒表面，處于機體免疫壓力下易發(fā)生變異而形成不同的流行株。因此，對VP1蛋白核苷酸序列的研究，既可以確定HEV的基因型別，又可以說明病毒核酸之間的相似程度，提示它們之間同源性的大小，從而明確病毒來源及其傳播鏈。HEV-A可以引起AFP、無菌性腦膜炎、HFMD、皰疹性咽峽炎(Herpangina,HA)等多種疾病，其中以HFMD最為常見。而引起HFMD最常見的病原體為EV7

6、1和CVA16。山東省是HFMD的高發(fā)省份之一，自2007年至今每年都會發(fā)生HFMD的流行。本研究通過對近些年分離到的HEV-A山東地方株的基因型進行分析，特別是對HFMD病例標本中分離毒株的VP1蛋白的編碼基因進行分析，從分子流行病學角度探索HEV-A與HFMD的關(guān)系，為制訂HFMD及其HEV感染所致疾病的防治策略提供科學依據(jù)。
　　 目的：⑴了解HEV-A山東地方株的基因型分布，建立HEV-A山東地方株的VP1區(qū)基因核苷酸序

7、列數(shù)據(jù)庫；⑵分析HEV-A山東地方株主要型別的遺傳進化特征；⑶探討HEV-A主要型別與其所致疾病之間的聯(lián)系，分析遺傳變異對其致病性和流行規(guī)律的影響，為相關(guān)疾病的預防控制提供理論依據(jù)。
　　 方法：①對源于1998～2009年AFP監(jiān)測系統(tǒng)中的病例標本和2007～2010年部分HFMD病例標本，采用細胞培養(yǎng)的方法進行病毒分離，陽性分離物利用HEV組合血清進行中和試驗，確定其血清型。②對病毒分離陽性但中和試驗無法定型的毒株，提取核酸

8、并進行VP1基因擴增和序列測定。③將測得的基因序列進行剪裁、拼接，得到VP1區(qū)基因核苷酸序列。利用NCBI提供的BLAST服務(wù)器進行序列比對，確定HEV-A山東地方株的基因型別。④將HEV-A山東地方株與GenBank中檢索到的其它國家和地區(qū)分離株，采用BioEdit Sequence Alignment Editor software5.0.9軟件，對其VP1區(qū)核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性比較。⑤采用Mega3.1軟件，以

9、相鄰連接方法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建VP1區(qū)系統(tǒng)發(fā)生樹，對HEV-A山東地方株進行親緣進化分析。
　　 結(jié)果：⑴山東省目前分離到10個基因型的HEV-A，分別為CVA4、CVA5、CVA6、CVA10、CVA12、CVA14、CVA16、EV71、EV76和EV90。⑵CVA4山東地方株與其原型株VP1區(qū)部分基因核苷酸和氨基酸同源性分別為83.8％～85.3％和97％～99.6％，相對于CVA4原型

10、株，主要表現(xiàn)為核苷酸的變異，氨基酸序列存在4個主要變異位點；VP1區(qū)部分基因系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，CVA4可以劃分為A～E5個基因簇(Cluster)，山東地方株分別位于Cluster C和E。⑶CVA6山東地方株與其原型株VP1區(qū)部分基因核苷酸和氨基酸同源性分別為81.3％～81.5％和94.4％～95.0％;VP1區(qū)部分基因系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，CVA6可以劃分為A～C3個Cluster，山東地方株位于Cluster C，并來自同一傳播鏈(Li

11、neage)。⑷CVA10山東地方株與其原型株VP1區(qū)部分基因核苷酸和氨基酸同源性分別為75.6％～76.8％和90.2％～93.2％;VP1區(qū)部分基因系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，CVA10可以劃分為A～G共7個Cluster，山東地方株分別位于Cluster F和G。⑸CVA16山東地方株與其原型株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為75.5％～77.1％和91.5％～92.2％；VP1區(qū)全基因系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，CVA16可以劃分為A、B2個基因型，

12、山東地方株存在B1a和B1b2個傳播鏈(Lineage)的共循環(huán)。⑹EV71山東地方株與其原型株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為82.0％～82.9％和94.2％～95.2％，與C4亞型核苷酸同源性最高，為91.8％～93.7％;VP1區(qū)全基因系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，EV71可以劃分為A、B、C3個基因型；山東地方株均屬于其中的C4亞型，所有C4亞型毒株在第249位氨基酸上表現(xiàn)為與C1～C3亞型不同的氨基酸變異(I→V)。⑺2007年臨沂市H

13、FMD暴發(fā)主要病原為EV71，且位于C4亞型的C4a進化分支；2008～2010年山東省HFMD流行的主要病原體為EV71和CVA16，兼有CVA4、CVA6、CVA10等其它HEV-A的參與。
　　 結(jié)論：①EV71和CVA16是山東省HEV-A的優(yōu)勢型別，其它基因型HEV-A也有分布，并在HFMD等疾病的暴發(fā)與流行中占有一定的比例。②HEV-A山東地方株的遺傳進化存在一定的方向性和穩(wěn)定性。相比CVA16，EV71有較快的進化

14、速率，目前分離到的EV71山東地方株均屬于同一進化來源(C4a)，CVA16山東地方株存在2個傳播鏈的共循環(huán)。③部分基因型HEV-A山東地方株的遺傳進化存在著一定的地域分布特征。HEV-A各基因型在長期共同進化的過程中可能發(fā)生型內(nèi)或型間重組。④EV71是中國大陸近些年發(fā)生HFMD的暴發(fā)和流行的主要病原，其結(jié)構(gòu)蛋白VP1區(qū)遺傳進化較穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)基因重組。自1998年以來C4a是中國大陸唯一流行的EV71的基因亞型，推測其非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)發(fā)