人類(lèi)腸道病毒B組山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組和進(jìn)化起源的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、[背景]
　　 人類(lèi)腸道病毒(HEV)隸屬于小核糖核酸（Ribonucleic Acid, RNA）病毒目（Picornavirales）小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），基因組為單股正鏈RNA。病毒基因組的5'非編碼區(qū)含有基因組RNA復(fù)制和翻譯所需的結(jié)構(gòu)，3'非編碼區(qū)具有與基因組復(fù)制有關(guān)的高度保守的二級(jí)機(jī)構(gòu)及多聚腺苷酸(polyA)尾。編碼區(qū)分為結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(P1)和非結(jié)構(gòu)蛋

2、白編碼區(qū)(P2和P3)。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(P1)依次編碼VP4、VP2、VP3和VP1共4個(gè)衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1蛋白位于病毒顆粒最外側(cè)，含有主要的抗原位點(diǎn)，是進(jìn)行基因分型和分子流行病學(xué)研究最主要的靶基因。
　　 根據(jù)VP1序列核苷酸差異，HEV分為HEVA組（HEV-A）、B組(HEV-B)、C組(HEV-C)和D組(HEV-D)4個(gè)組。目前，HEV-B包含59個(gè)血清型，為4個(gè)組中所含血清型最多的一組。HEV-B病毒不僅血清型

3、別眾多，而且流行范圍廣泛，可導(dǎo)致多種疾病的暴發(fā)流行，加之HEV基因組變異迅速，新的血清型不斷出現(xiàn)，因而HEV-B血清型病毒成為當(dāng)前研究關(guān)注的熱點(diǎn)之一。
　　 早在50多年前，人們就發(fā)現(xiàn)RNA病毒間復(fù)雜的基因變異。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在全球多個(gè)脊髓灰質(zhì)炎（以下簡(jiǎn)稱(chēng)脊灰）病毒(PV)減毒活疫苗免疫覆蓋率低的地區(qū)，多次出現(xiàn)由重組后的脊灰疫苗衍生株病毒循環(huán)(cVDPVs)導(dǎo)致的脊灰暴發(fā)，使消滅脊灰的免疫策略及疾病監(jiān)測(cè)變得更為復(fù)雜，也引起人

4、們對(duì)HEV遺傳變異機(jī)制的研究產(chǎn)生了新的興趣，更加關(guān)注HEV基因組的易變性，為研究HEV的進(jìn)化提供了新的視點(diǎn)。
　　 HEV基因組的進(jìn)化方式包括核苷酸點(diǎn)突變和遺傳重組。P1編碼區(qū)的進(jìn)化幾乎均由核苷酸替換所引起的點(diǎn)突變驅(qū)動(dòng)的。P2和P3區(qū)編碼病毒復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白和酶，這些多肽蛋白序列的相對(duì)保守，功能相對(duì)穩(wěn)定，而大多數(shù)點(diǎn)突變對(duì)于蛋白和酶的功能來(lái)說(shuō)是不利的，基因重組成為其進(jìn)化的主要手段。HEV的進(jìn)化就是基因組的各個(gè)部分在以不同方式進(jìn)

5、化的同時(shí)，通過(guò)遺傳重組而產(chǎn)生出的被自然選擇的優(yōu)勢(shì)毒株的過(guò)程。由于3D編碼區(qū)位于基因組的3'末端，故比較VP1和3D基因在系統(tǒng)發(fā)生上的差異，可作為篩選重組發(fā)生的指標(biāo)。
　　 在過(guò)去20多年里，山東省從急性弛緩性麻痹(AFP)、無(wú)菌性腦膜炎(AM)2種疾病監(jiān)測(cè)病例分離到上千株HEV山東株，其中多數(shù)屬于HEV-B，且有些HEV-B血清型呈現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)血清型。HEV感染已成為嚴(yán)重威脅廣大人群特別是兒童身體健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一

6、。因此，運(yùn)用分子流行病學(xué)的方法，通過(guò)對(duì)HEV-B優(yōu)勢(shì)血清型山東株基因序列的分析，探索HEV-B在區(qū)域性引入和擴(kuò)散過(guò)程中VP1進(jìn)化遺傳學(xué)和居群動(dòng)力學(xué)特征，分析不同血清型間重組在HEV進(jìn)化中的發(fā)生頻率，對(duì)于HEV所致相關(guān)疾病的機(jī)制及其預(yù)防控制均具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 [研究目的]
　　 1.構(gòu)建并完善HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型(CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Ech

7、o19、Echo25、Echo30)的VP1區(qū)和3D區(qū)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行基因特征研究。
　　 2.探討HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組的發(fā)生，闡明各主要血清型在山東省共循環(huán)過(guò)程中的基因重組規(guī)律及重組基因片段的轉(zhuǎn)移方向和頻率。
　　 3.分析HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型的基因序列起源、進(jìn)化速度及流行史重構(gòu)等進(jìn)化起源特征。
　　 [研究方法]
　　 1.毒株來(lái)源:本研究所選毒株來(lái)自山東省1989～2010

8、年AFP和AM2種疾病監(jiān)測(cè)病例。實(shí)驗(yàn)前接種RD或Hep-2細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖。
　　 2.基因測(cè)序:提取病毒RNA，RT-PCR擴(kuò)增VP1和3D區(qū)基因片段，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。
　　 3.型別鑒定:將各血清型的VP1序列通過(guò)NCBI在線(xiàn)提供的BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，確定HEV山東株的血清型別。
　　 4.生物信息學(xué)分析:使用Mega4.0軟件，構(gòu)建VP1區(qū)和3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分

9、析HEV山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組情況。通過(guò)BEAST1.6.2軟件分析HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型的進(jìn)化遺傳學(xué)特征，重構(gòu)優(yōu)勢(shì)血清型毒株在山東省內(nèi)的流行史。
　　 [主要結(jié)果]
　　 1.HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型的確定:在前期研究中，已通過(guò)HEV分子生物學(xué)定型方法對(duì)部分山東株的血清型別進(jìn)行鑒定。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)1989～2010年分離自山東省AFP和AM監(jiān)測(cè)病例的HEV山東株進(jìn)行型別鑒定，共鑒別出非脊灰腸道病毒

10、(NPEV)1010株，涵蓋58個(gè)HEV血清型別。其中，CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30這10個(gè)血清型在山東省歷年HEV檢測(cè)中共分離到792株，占所有已定血清型分離株的78.4％(792/1010)，為HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型別。
　　 2.HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型基因重組分析:本研究共選取458株HEV-B山東株3D序列進(jìn)行序列分析。

11、通過(guò)構(gòu)建3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，山東省10個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型毒株間在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)內(nèi)存在頻繁的基因重組現(xiàn)象，山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中共劃分為13個(gè)主要的基因簇。
　　 (1)3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，每個(gè)基因簇所包含血清型別不盡相同，同一血清型的山東株在3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分處不同的基因簇。每個(gè)基因簇的山東分離株歸屬于2～9個(gè)HEV血清型，第1、4、6、8、12、13基因簇為優(yōu)勢(shì)基因簇。
　　 (2)3D編碼區(qū)不同基因簇的主要分離

12、時(shí)間不完全相同。3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基因簇的最長(zhǎng)分離時(shí)間跨度為21年，各基因簇平均優(yōu)勢(shì)分離時(shí)間跨度約為15（14.8±4.6）年。
　　 3.HEV-B山東株優(yōu)勢(shì)血清型進(jìn)化起源分析:本研究所選10個(gè)HEV-B山東優(yōu)勢(shì)血清型毒株的祖先約起源于1885～1913年之間，不同血清型VP1區(qū)核苷酸序列每年每個(gè)堿基位點(diǎn)的進(jìn)化速度為1.007×10-3～9.856×10-3。其中，CVA9、Echo6、Echo7、Echo25血清型山東株與來(lái)自

13、中國(guó)其他省份和世界各地的分離株存在共同的進(jìn)化祖先，而CVB3、Echo11、Echo14、Echo19、Echo30血清型山東株僅與中國(guó)其他省份的相應(yīng)毒株有共同的祖先起源。
　　 [主要結(jié)論]
　　 1.CVA9、 CVB3、 CVB5、 Echo6、 Echo7、 Echo11、 Echo14、 Echo19、 Echo25、Echo30血清型為山東省HEV-B優(yōu)勢(shì)血清型。在長(zhǎng)達(dá)22年的AFP和AM疾病監(jiān)測(cè)中，本研究所

14、選10個(gè)血清型毒株在山東省歷年分離數(shù)明顯高于其他HEV血清型別，并且在山東省局部地區(qū)曾多次引起AM等相關(guān)疾病的暴發(fā)流行，為山東省內(nèi)共循環(huán)毒株的HEV-B優(yōu)勢(shì)血清型。
　　 2.基因重組是HEV非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)重要的進(jìn)化方式。HEV-B山東株在3D進(jìn)化樹(shù)中劃分為13個(gè)主要的基因簇，各基因簇中HEV-B血清型種類(lèi)和數(shù)量不同。同一血清型山東株位于多個(gè)基因簇，而不同基因簇的主要分離時(shí)間不完全相同。提示HEV-B山東株非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因片段轉(zhuǎn)移