腸道病毒71型感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景和目的：
　　 腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的成員，歸屬于人類腸道病毒A。目前已知EV71的感染可以導(dǎo)致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴(yán)重病理癥狀通常在兒童中發(fā)生。自1974年Schmidt等人首次報(bào)道從美國加利福尼亞暴發(fā)的表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病(1969～1973年)的患者中分離到EV71，隨后

2、，世界上許多國家相繼報(bào)道了EV71病毒在不同地區(qū)的流行情況，EV71病毒已在世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)與流行。盡管EV71的基因組和生命周期相似于小核糖核酸病毒科的其它成員，但相應(yīng)引起的病理癥狀明顯不同;至今尚無特異性的治療方法及有效的針對性的疫苗預(yù)防EV71的感染，因此明確EV71的致病機(jī)制對控制嬰幼兒手足口病的流行與有效治療該疾病具有十分重要的意義。
　　 相關(guān)研究證實(shí)在EV71患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous

3、system，CNS)的腦干、神經(jīng)元等部位都已檢測到EV71基因及抗原的存在，證明EV71能進(jìn)入CNS。目前，對于EV71進(jìn)入CNS的途徑有兩種理論，如同脊髓灰質(zhì)炎:病毒入血穿血腦屏障或通過末梢神經(jīng)沿逆軸突運(yùn)輸感染CNS。有關(guān)研究證實(shí)新生小鼠口服EV71后，早期可引起持續(xù)性病毒血癥和血腦脊液屏障通透性增加，推測EV71可通過血運(yùn)途徑傳播，但腦組織低水平的病毒數(shù)量提示血源性途徑并非累及CNS的主要途徑，所以EV71穿血腦屏障(blood

4、brain barrier,BBB)機(jī)制還未明確。眾所周知，BBB是循環(huán)和CNS之間一道主要的屏障，它限制著不同物質(zhì)在兩個(gè)部位之間的自由運(yùn)輸，對維持CNS的體內(nèi)平衡起著一個(gè)關(guān)鍵的角色，故明確EV71穿BBB的機(jī)制對于防治EV71所致的CNS感染有重要意義，這亦是我們想探討的內(nèi)容。我們知道，病毒感染過程的第一步是病毒通過與位于細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而吸附于被感染的細(xì)胞的表面，然后利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞或?qū)⒉《镜暮怂後尫胚M(jìn)細(xì)胞。所以我

5、們推測構(gòu)成BBB的主要成分之一內(nèi)皮細(xì)胞可能是EV71的易感細(xì)胞，EV71與其結(jié)合而導(dǎo)致BBB結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，從而感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究采用分離鑒定的來自于重癥手足口病患者的EV71毒株感染HBMEC，形態(tài)學(xué)觀察HBMEC的細(xì)胞病變、透射電鏡檢測HBMEC中EV71的超微結(jié)構(gòu)與Real-Time PCR方法以檢測HBMEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EV71拷貝數(shù)變化情況，以探討EV71是否能感染HBMEC并能在其中復(fù)制;且進(jìn)一步檢測EV71是

6、否可以誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞骨架的改變并誘導(dǎo)其凋亡。最后，因?yàn)椴《境晒?shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制需要克服細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生的各種免疫防衛(wèi)反應(yīng)，阻斷或影響宿主細(xì)胞的正常循環(huán)機(jī)制，利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量合成病毒自身物質(zhì)，這種相互作用最終會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)模式的改變，這種改變影響著宿主細(xì)胞的正常生理功能，決定和反映著病毒感染致病的進(jìn)程和結(jié)果。為了研究EV71感染HBMEC后宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)模式的改變，為揭示病毒與HBMEC的相互作用

7、機(jī)制、病毒的分子致病機(jī)制、尋找病毒的作用靶標(biāo)等研究提供有意義的信息。本研究采用2-D技術(shù)分析HBMEC感染EV71后1h、16h、24h時(shí)間點(diǎn)與正常HBMEC的培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)差異點(diǎn)，然后對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶切，提取肽片段，最后用MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)獲得PMFMSMS圖，并利用Internet上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對肽質(zhì)量進(jìn)行檢索，尋找具有相似肽質(zhì)量指紋圖的蛋白質(zhì)，鑒定了差異率＞2.5的蛋白。并采用免疫印跡方法進(jìn)一

8、步對其中波形蛋白(vimentin)差異蛋白的變化進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 二、方法：
　　 1、分離與鑒定來自于臨床診斷為重癥手足口病患者的EV71毒株
　　 采用來自于臨床診斷為重癥手足口病患者的糞便或肛拭子，經(jīng)腸道病毒通用型引物及EV71特異性引物檢測初步診斷為EV71感染。再經(jīng)RD細(xì)胞分離增殖病毒，并采用EV71(226bp)引物與EV71VP1全基因序列(1086bp)引物進(jìn)行RT-PCR再次鑒定，并測序與b

9、last比對證實(shí)。
　　 2、EV71對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的感染
　　 采用已分離鑒定的EV71毒株感染HBMEC并設(shè)置空白對照組:觀察HBMEC感染EV71后不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)改變，并采用兔抗-EV71多克隆抗體檢測HBMEC內(nèi)EV71抗原的存在，透射電鏡直接觀察EV71作用HBMEC內(nèi)是否存在EV71病毒顆粒，并采用(226bp)EV71特異性引物對EV71感染HBMEC和RD細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清液行定量Real-

10、Time PCR，以檢測HBMEC和RD細(xì)胞感染EV71不同時(shí)間點(diǎn)分泌的EV71拷貝數(shù)變化以得出EV71在HBMEC的復(fù)制趨勢圖。
　　 3、采用JC-1線粒體早期凋亡試劑盒檢測EV71感染HBMEC8h時(shí)能否導(dǎo)致HBMEC的早期線粒體膜電位降低;采用Annexin-VFITC/PIkit檢測EV71能否導(dǎo)致HBMEC的凋亡;采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色以探討EV71感染HBMEC能否導(dǎo)致HBMEC細(xì)胞骨架的重排。
　　 4

11、、EV71感染HBMEC差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究
　　 采用分離EV71毒株在不同時(shí)間點(diǎn)感染HBMEC，收集裂解細(xì)胞，采用Bradford染色液定量蛋白，一向等電聚焦，二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并進(jìn)行銀染和考染，銀染膠用來分析、考染膠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。采用ImageScanner掃描儀對膠進(jìn)行掃描，凝膠圖像用ImageMaster7.0進(jìn)行分析。設(shè)置差異點(diǎn)倍數(shù)為2.5倍，對差異點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，剔除單塊膠個(gè)別豐度過高或低的點(diǎn)

12、。挖取差異點(diǎn)進(jìn)行酶切，通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜和蛋白信息數(shù)據(jù)庫建立差異蛋白質(zhì)譜。并對鑒定出的蛋白進(jìn)行功能分析，并采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定出的差異蛋白vimentin在HBMEC感染EV71不同時(shí)間點(diǎn)及正常HBMEC中的表達(dá)。
　　 三、統(tǒng)計(jì)分析：
　　 數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率以及HBMEC與RD細(xì)胞兩組間的EV71拷貝數(shù)比較采用兩個(gè)重復(fù)測量因素的方

13、差分析，線粒體凋亡采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)統(tǒng)計(jì)圖采用Excel或Origin繪圖軟件制作。
　　 四、結(jié)果：
　　 1、分離鑒定出一株重癥EV71毒株。
　　 2、從形態(tài)學(xué)觀察，EV71可以導(dǎo)致HBMEC的細(xì)胞病變，隨著感染時(shí)間延長，病變程度愈嚴(yán)重;通過透射電鏡可以發(fā)現(xiàn)EV71處理HBMEC內(nèi)存在直徑20～30nm的病毒顆粒;采用抗EV71多克隆抗體進(jìn)一步證實(shí)EV71組HBMEC

14、內(nèi)EV71抗原的存在;而采用EV71特異性引物行實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明EV71能感染HBMEC，并且可在HBMEC內(nèi)復(fù)制，其拷貝數(shù)在感染第3天達(dá)到最高峰，其復(fù)制最高峰出現(xiàn)時(shí)間比EV71易感細(xì)胞RD細(xì)胞早，但最終拷貝數(shù)低于RD細(xì)胞(P＜0.01);通過采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色證實(shí)EV71感染HBMEC能導(dǎo)致HBMEC細(xì)胞骨架的重排;另外采用JC-1試劑盒證實(shí)EV71能在8h誘導(dǎo)HBMEC早期凋亡;采用annexin-VFITC/PI凋亡檢

15、測試劑盒檢測到EV71能誘導(dǎo)HBMEC的凋亡，而隨著感染時(shí)間的延長，主要以細(xì)胞壞死為主，感染時(shí)間對EV71感染所誘導(dǎo)的凋亡和壞死有顯著影響(P＜0.01)。
　　 3、通過雙向凝膠電泳與質(zhì)譜鑒定，初步鑒定了HBMEC感染EV71在0、1、16、24h的28個(gè)差異表達(dá)蛋白。
　　 4、通過免疫印跡對EV71感染HBMEC與HBMEC的差異表達(dá)蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證，證實(shí)EV71感染HBMEC可以誘導(dǎo)Vimentin的表達(dá)下調(diào)，與蛋

16、白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 五、結(jié)論：
　　 1、我們分離鑒定了來自于重癥手足口病患者的EV71野生毒株，體外模擬EV71感染HBMEC模型。
　　 2、通過形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光和透射電鏡方法證實(shí)EV71能感染HBMEC;采用Real-timePCR方法進(jìn)一步證實(shí)EV71能在HBMEC內(nèi)復(fù)制，這說明HBMEC是EV71的易感細(xì)胞，但復(fù)制效率低于RD細(xì)胞。HBMEC上可能存在EV71的特異性受體，EV71與BBB內(nèi)皮

17、細(xì)胞上特異性受體結(jié)合進(jìn)而通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞里面復(fù)制，導(dǎo)致其形態(tài)與功能改變而穿BBB入腦。
　　 3、采用JC-1線粒體凋亡檢測試劑盒證實(shí)EV71感染HBMEC能誘導(dǎo)其線粒體膜電位降低，并且采用Annex-VFITC/PI染色方法證實(shí)EV71能誘導(dǎo)HBMEC的凋亡，隨著感染時(shí)間延長，細(xì)胞主要以壞死為主。說明EV71可誘導(dǎo)HBMEC線粒體的凋亡，而線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙是各種刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中心事件，并由此導(dǎo)致線粒體內(nèi)凋亡誘發(fā)

18、因子的釋放，參與對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，而引起了HBMEC的凋亡。
　　 4、EV71感染HBMEC能導(dǎo)致HBMEC細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的重排，而微絲結(jié)構(gòu)的改變可能對于病毒的復(fù)制和活化也起到一定的輔助作用。
　　 5、蛋白質(zhì)組學(xué)研究共發(fā)現(xiàn)EV71感染HBMEC進(jìn)程中28個(gè)差異表達(dá)蛋白，按功能分為9類。結(jié)合差異譜中表達(dá)量發(fā)生改變的蛋白的功能與EV71感染和未感染HBMEC蛋白表達(dá)量變化分析，發(fā)現(xiàn)了一些在感染中有重要意義的分子靶標(biāo)。