腸道病毒71型分離鑒定及其致病機(jī)制的初步探討.pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員，是引起嬰幼兒手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一。輕癥患者只引起發(fā)熱、皰疹等癥狀，重癥患者會(huì)引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)癥狀如無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等，病死率較高。目前EV71的致病機(jī)制尚不明確，不同臨床癥狀的產(chǎn)生可能是由于病毒

2、毒力不同，也可能是個(gè)體易感性的不同。
　　 本研究首先采集HFMD患兒的糞便標(biāo)本，運(yùn)用RD細(xì)胞分離腸道病毒并對(duì)其進(jìn)行EV71的鑒定;其次對(duì)EV71的全基因組序列進(jìn)行分析，尋找基因組序列上的差異;最后分別在5' UTR、VP2、3D區(qū)的基礎(chǔ)上對(duì)EV71的致病機(jī)制進(jìn)行研究，以尋找EV71致神經(jīng)系統(tǒng)病變的原因，為闡明EV71的致病機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.從HFMD患者的糞便標(biāo)本中分離EV71，為進(jìn)一

3、步的序列研究提供基礎(chǔ)。
　　 2.了解山東省臨沂市分離的EV71病毒株的全基因組序列特征，尋找不同臨床癥狀病毒株基因組序列上的差異，為進(jìn)一步研究提供毒力候選位點(diǎn)。
　　 3.對(duì)EV715' UTR、VP2、3D區(qū)的毒力候選位點(diǎn)進(jìn)行研究，探索EV71的致病機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.將采集自2009～2010年山東省臨沂市HFMD患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行處理，接種于RD細(xì)胞進(jìn)行初步分離，運(yùn)用腸道病毒通用引物及

4、EV71特異性引物對(duì)分離到的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，篩選出EV71。
　　 2.根據(jù)GenBank中EV71的基因組序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)SDLY11病毒株進(jìn)行全基因組序列擴(kuò)增并測(cè)序，運(yùn)用DNAstar和MEGA4軟件對(duì)EV71的全基因組序列進(jìn)行分析。
　　 3.根據(jù)SDLY01、SDLY11、SDLY48、SDLY96、SDLY107、SDLY153病毒株的全基因組序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)8株EV71的5'UTR區(qū)進(jìn)行RT-

5、PCR擴(kuò)增并序列分析。
　　 4.參考SDLY11、SDLY107全序列測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)VP2、3D區(qū)擴(kuò)增引物，以構(gòu)建表達(dá)載體VP2-pBluescriptSK(+)、3D-Flag-pcDNA3.1，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)表達(dá)蛋白，并檢測(cè)蛋白的致細(xì)胞病變作用。乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)(LDH)檢測(cè)不同臨床癥狀病毒株的VP2蛋白、3D蛋白對(duì)細(xì)胞損傷的影響，Annexin-V與PI的聯(lián)合使用可檢測(cè)3D蛋白引起的細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)3D

6、蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究分離了2009～2010年的24份標(biāo)本，經(jīng)初步鑒定20份標(biāo)本為EV71，4份標(biāo)本為非EV71的腸道病毒，其中采集自2009年的22份樣本中有18例為EV71(81.8％)。
　　 2.SDLY11病毒株基因組全長(zhǎng)7405nt，5'UTR包含742nt，3'UTR包含84nt，中間為6579nt的ORF，編碼2193個(gè)氨基酸的多聚蛋白。經(jīng)序列分析顯示，SDLY1

7、1屬于EV71的C4亞型。通過(guò)輕重癥患者病毒株進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)5' UTR中的2處核苷酸突變(T40C、C575T)及VP2區(qū)的氨基酸突變(T144S)可能與病毒引起不同臨床癥狀有關(guān)。
　　 3.8株EV71分離株的5'UTR區(qū)核苷酸序列為741nt～745nt，與C4亞型的同源性最高，不同臨床癥狀病毒株的5' UTR進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)有2處核菅酸位點(diǎn)突變(G265A、G703T)。
　　 4.SDLY11、SDLY107

8、兩個(gè)病毒株的VP2蛋白均可在Vero細(xì)胞中表達(dá)，LDH實(shí)驗(yàn)對(duì)VP2蛋白引起的細(xì)胞損傷程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組未出現(xiàn)明顯不同。
　　 5.SDLY11、SDLY107的3D蛋白可在RD細(xì)胞中表達(dá)，LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SDLY11株3D蛋白轉(zhuǎn)染組造成的細(xì)胞損傷程度大于SDLY107株3D蛋白轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞凋亡結(jié)果未有明顯不同，而進(jìn)一步的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDLY107株3D蛋白轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于SDLYll株3D蛋白轉(zhuǎn)染組。<

9、br>　　 結(jié)論:
　　 1.初步判定2009年山東省臨沂市流行的HFMD以EV71為主，SDLY11為C4亞型，為近年來(lái)中國(guó)大陸地區(qū)流行的EV71亞型。
　　 2.5' UTR區(qū)的4處突變(T40C、G265A、C575T、G703T)可能與病毒產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀相關(guān)，這可為進(jìn)一步的研究提供候選位點(diǎn)。
　　 3.不同臨床癥狀病毒株的VP2蛋白可能對(duì)細(xì)胞損傷的影響不大，但3D蛋白會(huì)引起細(xì)胞損傷情況、細(xì)胞增殖能力