RD細(xì)胞腸道病毒71型受體的篩選和初步鑒定.pdf

1、研究背景：
　　腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬的成員，是引起兒童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)暴發(fā)流行的主要病原之一。EV71感染不僅可以引起兒童手足口病，嚴(yán)重者還能引發(fā)一系列與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的并發(fā)癥如無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、心肌炎和肺水腫等，病死率高。EV71病毒受體的鑒定對(duì)于明確病毒感染的宿主范圍、組織

2、和細(xì)胞嗜性，明確病毒-宿主之間的相互作用和致病機(jī)理有著重要的作用。目前EV71受體的研究已經(jīng)取得突破性的進(jìn)展，已鑒定出EV71的兩個(gè)不同受體:SCARB2和PSGL-1。因?yàn)镻SGL-1主要在白細(xì)胞上表達(dá)，所以它不可能在非白細(xì)胞（比如神經(jīng)細(xì)胞，上皮細(xì)胞）上作為受體。此外，用兩者的配體或抗體都無(wú)法完全阻斷 EV71對(duì)宿主細(xì)胞的感染。這些都提示 EV71受體不只一種，PSGL-1是否為第二受體，與PSGL-l無(wú)關(guān)的T細(xì)胞感染是否由SCARB

3、2介導(dǎo)或是由其它受體介導(dǎo)還未可知。由此推測(cè)，應(yīng)當(dāng)存在一種或多種未知的EV71受體或受體輔助分子。
　　研究目的：
　　篩選和鑒定RD細(xì)胞上能與腸道病毒71型（EV71）VP1蛋白結(jié)合的受體蛋白，為進(jìn)一步深入研究EV71病毒受體特性和功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、EV71病毒的快速純化及鑒定：EV71病毒在恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK2)細(xì)胞中增殖后，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)反復(fù)凍融、聚乙二醇6000沉淀、差

4、速離心、氯化銫墊層超速離心的方法純化病毒。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫印跡(Western blot)和透射電鏡(TEM)的方法對(duì)純化病毒進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其感染性滴度及回收率。
　　2、EV71病毒候選受體的篩選：大量培養(yǎng)RD細(xì)胞后提取膜蛋白，雙向凝膠電泳分離RD細(xì)胞膜蛋白后，通過(guò)Far-western印跡實(shí)驗(yàn)篩選能與EV71病毒VP1蛋白相互作用的RD細(xì)胞膜蛋白，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)

5、間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)特異性結(jié)合的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。
　　3、病毒候選受體的初步鑒定：采用免疫共沉淀試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證SLP-2蛋白與EV71病毒之間的相互作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、病毒純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后顯示出三條帶，相對(duì)分子量分別為34KD、30KD、26KD與EV71的VP1、VP2和VP3蛋白相符合。Western blot證實(shí)34KD的條帶為EV71的VP1蛋白。經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀察，能

6、看到典型病毒顆粒。終濃度為10％的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率為82%，再經(jīng)氯化銫墊層超速離心后濃縮病毒的感染性回性率為29.0%。
　　2、通過(guò)Far-western印跡檢測(cè)，從RD細(xì)胞上篩選到4個(gè)能與EV71結(jié)合的蛋白點(diǎn)。質(zhì)譜分析僅鑒定出一個(gè)膜蛋白，即stomatin-like protein2(SLP-2)。免疫共沉淀試驗(yàn)顯示SLP-2蛋白能與EV71發(fā)生特異性的結(jié)合。
　　研究結(jié)論：
　　1、聚乙