基于缺陷型復(fù)制子的71型腸道病毒檢測細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、【目的】
　　構(gòu)建用于檢測外源71型腸道病毒（Human enterovirus71，EV71）的穩(wěn)定細(xì)胞系，并對其檢測方法的特異性和敏感性進(jìn)行評價(jià)。
　　【方法】
　　1.用含有綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因的EV71感染性cDNA克隆pWSK-EV71-GFP作為分子模板，缺失EV71的4個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白基因，擴(kuò)增出基因片段5'-UTR+ GFP+2A Re

2、cognition sequence+3'-UTR+PolyA，以真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）為骨架，經(jīng)BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后，構(gòu)建用于EV71檢測的缺陷型真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-△EV71-GFP。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法以質(zhì)粒pcDNA3.1-△EV71-GFP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h，細(xì)胞感染EV71，同時(shí)用感染同為正鏈 RNA病毒的甲病毒屬辛德畢斯病毒（ Sindbis Virus， SINV-XJ-

3、160）、黃病毒屬乙腦病毒（Japanese encephalitis Virus，JEV-P3）的細(xì)胞組做對照，在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況。
　　2.為了構(gòu)建基于缺陷型復(fù)制子的EV71檢測細(xì)胞系，將方法1中擴(kuò)增出的基因片段5'-UTR+ GFP+2A Recognition sequence+3'-UTR+ PolyA克隆到慢病毒載體pLV-Puro的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS

4、），制備EV71啟動序列修飾的、含有GFP報(bào)告基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV-GFP。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pLV-GFP和包裝質(zhì)粒Helper共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48h后收集感染細(xì)胞的上清液。用收集的慢病毒顆粒再感染BHK-21細(xì)胞，并經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選獲得陽性多克隆細(xì)胞株。經(jīng)96孔板系列稀釋法二次篩選后，獲得生長狀況良好的單克隆細(xì)胞株，用作EV71檢測細(xì)胞系的候選株。經(jīng)功能鑒定獲得可用于 EV71檢測的工程細(xì)胞系 BHK/GFP。

5、用BHK/GFP細(xì)胞分別感染辛德畢斯病毒、乙腦病毒感染做對照，根據(jù)熒光蛋白的表達(dá)情況來評價(jià)檢測方法的特異性。用BHK/GFP細(xì)胞感染不同稀釋滴度的EV71，觀察GFP的表達(dá)情況，來評價(jià)檢測方法的靈敏性。
　　【結(jié)果】
　　1.轉(zhuǎn)染缺陷型復(fù)制子pcDNA3.1-△EV71-GFP的BHK-21細(xì)胞在感染EV71后，可以觀察到特異的綠色熒光，空白對照組細(xì)胞則無綠色熒光蛋白表達(dá)，表明缺陷復(fù)制子轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞可用于外源EV7

6、1的檢測。同時(shí)，轉(zhuǎn)染缺陷型復(fù)制子的BHK-21細(xì)胞感染辛德畢斯、乙腦病毒等單股正鏈RNA病毒后均未觀察到綠色熒光，提示本檢測方法具有良好的特異性。
　　2.慢病毒工程載體pLV-GFP和包裝質(zhì)粒Helper共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后收集慢病毒顆粒，并經(jīng)轉(zhuǎn)染、壓力篩選及系列稀釋后成功獲得EV71檢測細(xì)胞系的單克隆細(xì)胞株BHK/GFP。BHK/GFP細(xì)胞感染EV7148h時(shí)可觀察到綠色熒光，說明此細(xì)胞系可以用于EV71檢測。與之相比，

7、對照組的BHK/GFP細(xì)胞感染辛德畢斯病毒、乙腦病毒后均未觀察到綠色熒光，提示以此細(xì)胞系為基礎(chǔ)的EV71檢測方法特異性良好。BHK/GFP細(xì)胞感染滴度為10 PFU/mL（Plaque forming units，PFU）及以上的EV71后，可觀察到特異的綠色熒光。而BHK/GFP細(xì)胞感染滴度為1 PFU/mL的EV71后則不能觀察到綠色熒光。表明BHK/GFP檢測細(xì)胞系的靈敏系為1～10 PFU/mL。
　　【結(jié)論】