抑制腸道病毒71型復(fù)制的microRNA和先導(dǎo)化合物的研究.pdf

1、近年來，手足口病在世界多個(gè)地區(qū)，尤其是亞洲爆發(fā)并流行，且其感染和死亡率逐年增高，危害十分嚴(yán)重。腸道病毒71(Enterovirus71，EV71)是手足口病(Hand，foot，and mouth disease，HFMD)的主要病原體，以感染嬰幼兒為主，其感染常伴隨神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重可導(dǎo)致兒童死亡。因此，EV71的分子生物學(xué)研究，預(yù)防及治療EV71感染的藥物開發(fā)，已成為當(dāng)前病毒學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 miRNAs是在真核生

2、物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性長度約為22個(gè)核苷酸單鏈非編碼RNA，通過降解靶mRNA分子或抑制靶基因mRNA的翻譯，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控過程。已經(jīng)證實(shí)miRNAs在很多生物學(xué)過程中起著重要的作用，越來越多的研究表明miRNAs還參與調(diào)控病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的感染和復(fù)制過程，本文對miRNAs在宿主細(xì)胞內(nèi)調(diào)控EV71病毒的復(fù)制的作用進(jìn)行了研究。
　　 首先構(gòu)建了miRNAs靶基因篩選系統(tǒng)。我們在Luciferase雙檢測體系的pMIR載體

3、插入待檢基因，如果插入的基因序列能被細(xì)胞內(nèi)的miRNAs靶向調(diào)控，報(bào)告基因的表達(dá)將發(fā)生變化。通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)插入EV71病毒5’-UTR基因的pMIR載體，報(bào)告基因的表達(dá)下降了2.5倍左右。進(jìn)一步將5’-UTR基因打斷成260bp左右的片段，同樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)5’-UTR-1(1-270)片段使Luciferase的表達(dá)下降了2.5倍左右，所以推測5’-UTR-1片段可能是miRNAs的作用靶標(biāo)。
　　 隨后我們利用在線分析軟

4、件，預(yù)測可能作用于5’-UTR-1基因片段的miRNAs，選擇其中的miR-373和miR-542-5p合成minics，檢測miRNAs對5’-UTR-1基因片段的作用，結(jié)果顯示，二者都可以下調(diào)報(bào)告基因的表達(dá)。但miRNAs分子對5’-UTR-1基因的調(diào)控作用是否可以體現(xiàn)在EV71病毒的復(fù)制過程中?為此，我們選擇了miR-373和miR-542-5p做了進(jìn)一步研究。我們在RD細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNAs minics，6h后感染EV71病毒

5、。利用Western blot和real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)病毒的復(fù)制情況。結(jié)果顯示，miR-373和miR-542-5p可以抑制EV71病毒在RD細(xì)胞中的復(fù)制。但是miR-373和miR-542-5p的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　 本論文的另一部分內(nèi)容是進(jìn)行抗EV7l病毒復(fù)制的先導(dǎo)化合物的篩選。新藥的發(fā)現(xiàn)路徑大致為化合物庫的合成和靶的開發(fā)，高通量的篩選，選出有希望的先導(dǎo)化合物，接下來進(jìn)行先導(dǎo)化合物的最優(yōu)化，臨床實(shí)

6、驗(yàn)直到新藥的上市。本實(shí)驗(yàn)由武漢大學(xué)提供6種化學(xué)合成的醫(yī)藥中間體，3，4-二甲氧基苯甲酸甲酯(Methyl3，4-dimethoxybenzoate)，3，4-二甲氧基苯乙酸甲酯(Methyl3，4-dimethoxyphenylacetate)，D-對羥基苯甘氨酸甲酯(Methyl D-(-)-4-hydroxy-phenylglycinate)，4-氯苯甘氨酸((R)-4-Chlorophenyl glycine)，3，4-二羥基苯乙

7、酸甲酯(Methyl3，4-dihydroxyphenylacetatate)，4-氯-2-異丙基-5-甲苯酚(4-Chloro-5-methyl-2-(1-methylethyl)-phenol)以及2種五肽化合物-P010157和
　　 首先通過Western blot進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3，4-二羥基苯乙酸甲酯對EV71在RD細(xì)胞中的復(fù)制具有明顯的抑制效果。接下來利用MTT法初步檢測3，4-二羥基苯乙酸甲酯的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明C

8、C50為0.0726μg/μL，細(xì)胞毒性較低。Real-time PCR檢驗(yàn)3，4-二羥基苯乙酸甲酯對EV71病毒復(fù)制的影響，當(dāng)終濃度為0.01μg/μL時(shí)對EV71病毒復(fù)制的抑制率為76.83±2.47％。以上結(jié)果表明3，4-二羥基苯乙酸甲酯對EV71病毒在RD細(xì)胞中的復(fù)制具有抑制作用。感染EV71病毒的一日齡ICR乳鼠注射3，4-二羥基苯乙酸甲酯，生長狀態(tài)明顯好于陽性對照組，real-time PCR檢測3，4-二羥基苯乙酸甲酯對E

9、V71病毒在乳鼠體內(nèi)的復(fù)制具有很好的抑制效果。以上結(jié)果證明3，4-二羥基苯乙酸甲酯是一種具有開發(fā)潛力的抗EV71病毒復(fù)制藥物，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，并且還需要根據(jù)EV71病毒的基因組特點(diǎn)，優(yōu)化3，4-二羥基苯乙酸甲酯的結(jié)構(gòu)，合成效果更好的衍生物。
　　 采用同樣的思路對比2種五肽化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Western blot發(fā)現(xiàn)P010157能夠抑制EV71病毒在RD細(xì)胞中的復(fù)制，CC50大約可達(dá)到155.7378μg/