豬戊型肝炎病毒感染性克隆及復(fù)制子的構(gòu)建.pdf

1、戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一種急性、自限性人畜共患傳染病,該病主要經(jīng)糞-口途徑傳播,臨床病變以黃疸為主。主要暴發(fā)于發(fā)展中國(guó)家。
　　 繼1988-1989年我國(guó)新疆暴發(fā)戊型肝炎后,該病在我國(guó)開始散在分布。1997年,美國(guó)學(xué)者M(jìn)eng等首次在豬血清中分離到戊型肝炎病毒,隨后在其他各國(guó)也相繼報(bào)道了豬的戊型肝炎病毒,主要是HEV基因Ⅲ型和Ⅳ型,在我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)以基因型Ⅳ型為主。本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)并分離到的戊型肝炎病毒從屬于基因Ⅳ型,相關(guān)報(bào)道

2、顯示,人所感染的戊型肝炎病毒的基因序列與豬的戊型肝炎病毒的基因序列相比,基因Ⅳ型的同源性最高。
　　 由于缺乏有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)戊型肝炎病毒的復(fù)制及其轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢。為了打破這一瓶頸,panda等在2000年引入了感染性克隆技術(shù)。鑒于以上基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)對(duì)在華中地區(qū)戊型肝炎陽性病料中的病毒進(jìn)行了感染性克隆以及復(fù)制子的研究,主要內(nèi)容包括:
　　 (1)戊型肝炎病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 在已經(jīng)測(cè)通的

3、WH09株HEV的全基因組序列的基礎(chǔ)上,將HEV的全長(zhǎng)分割成5個(gè)片段分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆,測(cè)序,序列比對(duì)正確后將其按照全長(zhǎng)基因組的順序依次連在pCDNA3.1載體上,得到了含有戊型肝炎病毒全基因組的重組質(zhì)粒。
　　 (2)戊型肝炎病毒感染性克隆質(zhì)?；謴?fù)病毒活性的驗(yàn)證
　　 將質(zhì)粒在末端(載體上)線性化,純化后轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5,進(jìn)一步通過RT-PCR方法檢測(cè)到戊型肝炎病毒能夠在細(xì)胞中復(fù)制三代,且隨著復(fù)制代數(shù)增

4、加其活性也會(huì)逐漸消失,通過IFA的方法能夠檢測(cè)到病毒蛋白的表達(dá)。
　　 (3)戊型肝炎病毒的復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建與復(fù)制能力的恢復(fù)驗(yàn)證
　　 在戊型肝炎病毒的全基因組中缺失掉部分結(jié)構(gòu)基因,插入易于檢測(cè)的外源基因,構(gòu)建了分別含有外源基因IRES-EGFP、IRES—Luc的復(fù)制子,進(jìn)行驗(yàn)證,含有IRES-EGFP的復(fù)制子沒能找到發(fā)光的細(xì)胞,結(jié)果顯示含有IRES-Luc的復(fù)制子經(jīng)過雙熒光素酶的檢測(cè)能夠檢測(cè)到Luc的表達(dá),對(duì)缺失掉O