戊型肝炎病毒感染ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、戊型肝炎(HepatitisE)是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）引起的急性病毒性肝炎，主要通過(guò)糞口途徑傳播，常因飲用水源被污染導(dǎo)致暴發(fā)流行，散發(fā)病例呈全球性分布。自從學(xué)者M(jìn)eng第一次報(bào)道從豬體內(nèi)分離到HEV以后，許多學(xué)者進(jìn)行了動(dòng)物感染HEV的調(diào)查和實(shí)驗(yàn)感染研究，越來(lái)越多的證據(jù)提示HEV是一種人獸共患病病毒，許多動(dòng)物對(duì)HEV表現(xiàn)為易感，對(duì)于缺乏穩(wěn)定有效的HEV細(xì)胞培養(yǎng)體系的現(xiàn)狀，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于HEV的深入研究提供

2、重大突破。但是，具體的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅有非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物感染HEV效果比較好，其它動(dòng)物感染效果不佳。由于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的價(jià)格高、難飼養(yǎng)和數(shù)量有限等原因又限制了其應(yīng)用。選擇一個(gè)既感染效果好又經(jīng)濟(jì)適用的HEV小動(dòng)物感染對(duì)象用于HEV的實(shí)驗(yàn)研究很有必要，為此，本實(shí)驗(yàn)選用ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠作為HEV感染對(duì)象，開(kāi)展以下研究并獲取如下成果：
　　 第一部分糞便的采集和鑒定
　　 收集臨床確診為戊型肝炎的患者糞便6份，采用RT-n

3、PCR法獲得擴(kuò)增片段并連接至載體PMD-19T后進(jìn)行克隆測(cè)序鑒定，含HEV陽(yáng)性的標(biāo)本保存待用。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)從6份標(biāo)本中獲取1份HEV陽(yáng)性糞便，此糞便保存待用。
　　 第二部分熒光定量PCR檢測(cè)HEV方法的建立
　　 根據(jù)GenBank中提交的HEV全序列分析選取HEVORF2保守區(qū)域作為目的擴(kuò)增序列，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，建立熒光定量PCR檢測(cè)HEV的方法，并檢測(cè)其靈敏度和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量P

4、CR檢測(cè)HEV的方法，最高檢測(cè)靈敏度為5copies，在5×10'copies～5copoies標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)內(nèi)的8個(gè)點(diǎn)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2值達(dá)0.998。組內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)顯示其變異系數(shù)(CV)范圍在0.02％～1.40％之間，組間重復(fù)性檢測(cè)顯示其變異系數(shù)(CV)范圍在0.87％～2.24％之間，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
　　 第三部分戊型肝炎病毒感染ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)
　　 用做毒株的糞便經(jīng)

5、PBS混勻制成10％的糞懸液后分別經(jīng)直徑0.45μm和0.22μm過(guò)濾膜除菌，腹腔接種ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠100μl/只，對(duì)照組接種PBS100μl/只，ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠預(yù)先腹腔接種青霉素6萬(wàn)U/只，單只分籠養(yǎng)殖，按時(shí)喂養(yǎng)ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠并觀(guān)察記錄，每天收集糞便放于-70℃保存待檢。熒光定量PCR測(cè)定毒株糞便和收集糞便的HEV滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毒株糞便HEV滴度為4.1×103copies/g，實(shí)驗(yàn)組ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠最早于接種后第6天糞便