中國特有小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒感染性克隆的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、異種移植，就是通過將動物器官、組織、細(xì)胞等移植到人體內(nèi)，來解決機(jī)體組織器官功能障礙并達(dá)到治療的目的。而人源供體器官的嚴(yán)重短缺，就需要通過異種移植作為替代途徑解決。豬源器官的器官大小、生理學(xué)特點等都與人類相近，被認(rèn)為是最合適的異種移植供體。異種移植中除了各種排斥反應(yīng)、組織器官相容性等考慮外，最主要的擔(dān)憂就是異種移植人獸共患病的跨種傳播。研究發(fā)現(xiàn)豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)體外能

2、夠感染包括人源細(xì)胞在內(nèi)的多個細(xì)胞系，嚴(yán)重阻礙了豬→人異種移植的研究進(jìn)程。
　　 我國有著異常豐富的豬種資源，其中各種小型豬是適合醫(yī)學(xué)實驗研究和人類異種移植的優(yōu)良品種。目前我國的小型豬品系主要有：五指山豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬、版納小型豬等。在解剖學(xué)特征、生理學(xué)特性、營養(yǎng)代謝等方面與人類極為相似，非常適合用于人的異種器官移植，將來很有可能發(fā)展成為異種移植的優(yōu)良供體。本研究室在對我國主要小型豬PERV存在及表達(dá)情況的研究中發(fā)現(xiàn)

3、，所有不同種系中均存在PERV，但病毒拷貝數(shù)不同，其中五指山豬基因組中PERV的拷貝數(shù)較低，因而更適合于異種移植。
　　 PERV以前病毒DNA形式整合到豬細(xì)胞基因組中，并隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，因此無法從正常的細(xì)胞或組織中徹底消除。雖然大部分的研究結(jié)果均表明PERV并不引起任何感染性疾病，而且PERV感染人源細(xì)胞后也沒有發(fā)生細(xì)胞病變，但這種隱性感染是否會如同其它反轉(zhuǎn)錄病毒一樣通過潛在的與宿主細(xì)胞相互作用引發(fā)腫瘤或者癌變?一旦豬源

4、器官或細(xì)胞移植到高度免疫抑制的患者體內(nèi)時，PERV的跨種感染及表達(dá)情況又是如何?其潛在的病理效應(yīng)仍然是個不可輕視的問題。深入研究PERV分子生物學(xué)特性，能夠了解病毒的生命調(diào)控過程，闡明病毒感染、組裝、整合機(jī)制，為研究PERV與宿主細(xì)胞間的相互作用、探索PERV感染人源細(xì)胞后可能產(chǎn)生的效應(yīng)奠定分子基礎(chǔ)。
　　 然而，由于RNA病毒體外操作困難，對反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制、組裝和侵入分子機(jī)制，病毒生活周期以及病毒與宿主細(xì)胞相互作用等的研究進(jìn)

5、展一直停滯不前，直到二十世紀(jì)七十年代末，隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的推廣以及感染性克隆技術(shù)的廣泛應(yīng)用，RNA病毒的研究瓶頸得到突破并取得了諸多重大成就，該技術(shù)實現(xiàn)了在DNA分子水平上對RNA病毒的體外操作，是用于研究病毒組成結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能很好的方法，也稱之為病毒拯救。在國外，目前已構(gòu)建成功PERV-A、PERV-B等多株不同豬種感染性克隆，并對其復(fù)制機(jī)制以及分子生物學(xué)功能進(jìn)行系統(tǒng)研究，而我國至今尚未見PERV感染性克隆構(gòu)建的相關(guān)報道。

6、>　　 本研究以五指山來源小型豬為研究對象，構(gòu)建五指山豬來源PERV感染性克隆，為下一步研究五指山豬PERV分子生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。首先根據(jù)GenBank上PERV序列(No.EF133960)設(shè)計兩對引物分別用于擴(kuò)增PERV5'half和3'half兩個片段，并根據(jù)pBluescriptⅡ SK+載體特點，在5’half的5’端添加SalⅠ酶切位點。3’half的3’端添加XbaⅠ酶切位點，兩片段重疊處均有PERV中唯一的NheⅠ酶

7、切位點，首先通過PCR擴(kuò)增得到五指山豬PERV前病毒全基因，根據(jù)基因克隆和重組等技術(shù)獲得pBluescript SK+-WZS-PERV全基因克隆，并經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確。根據(jù)此方法共構(gòu)建9個PERV前病毒全基因克隆用于感染性克隆的篩選。將9個全基因克隆分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，經(jīng)PCR、RT-PCR鑒定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有1個全基因克隆轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中有PERV三種結(jié)構(gòu)基因的存在與表達(dá)，將該克隆命名為WZS-PERV(2)。收集轉(zhuǎn)染

8、后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，感染新的HEK293細(xì)胞，通過PCR鑒定PERV已經(jīng)整合入HEK293細(xì)胞基因組中。將病毒盲傳6代，采用基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量RT-PCR方法對PERVmRNA表達(dá)情況進(jìn)行初步分析，結(jié)果均為陽性，此外，相對定量分析結(jié)構(gòu)顯示各代次間PERV mRNA表達(dá)情況存在差異。采用SDS-PAGE電泳及Western Blot檢測分析PERV-Gag蛋白的表達(dá)情況，在WZS-PERV(2)轉(zhuǎn)染以及病毒感染后的HE

9、K293蛋白樣品中均出現(xiàn)60kDa、40kDa、27kDa的預(yù)期條帶，說明細(xì)胞中存在PERV-Gag蛋白的特異性表達(dá)。同時運用間接免疫熒光法分析PERV在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到PERV感染后HEK293細(xì)胞胞漿中顯示綠色熒光，進(jìn)一步證實細(xì)胞中表達(dá)了PERV-Gag蛋白。通過透射電子顯微鏡觀察到較典型的PERV病毒粒子。對感染性克隆進(jìn)行序列測定后發(fā)現(xiàn)，序列中g(shù)ag、pol、env三個編碼基因均具有完整的O

10、RF，以及兩端的LTR，基因組全長為8939bp，將序列與GenBank中其他PERV序列進(jìn)行比對分析，同時進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該序列的LTR中含有典型的21bp(417bp～437bp)-24bp(438bp～461bp)-37bp(464bp～500bp)區(qū)域，即與文獻(xiàn)中報道的PERVA/C重組毒株的LTR區(qū)域具有相同的特點，但存在數(shù)個堿基的突變，該結(jié)果初步說明：在本研究中獲得的五指山豬來源的PERV感染性克隆具有PERV-C

11、亞型的LTR及PERV-A亞型的受體結(jié)合區(qū)(RBD)序列，因此也屬于PERVA/C重組毒株，而且該克隆能夠在體外感染人胚腎細(xì)胞HEK293，即具有嗜人性特點。此外，通過生物信息學(xué)方法分析還發(fā)現(xiàn)，在LTR序列中的21bp-24bp-37bp區(qū)域，存在NF-Y等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，因此該區(qū)域應(yīng)為影響嗜人性PERV感染性的區(qū)域。
　　 結(jié)合前期對五指山豬的研究工作還發(fā)現(xiàn)，五指山豬近交系繁育多代后，PERV的序列中發(fā)生了較多的G→A突

12、變，結(jié)合目前天然免疫抗病毒分子豬APOBEC3F(pA3F)效應(yīng)機(jī)制分析，我們推測，可能是APOBEC家族成員pA3F的作用使PERV發(fā)生了較多G→A突變，但具體的作用機(jī)制以及發(fā)生突變的原因還有待進(jìn)一步驗證，因此本研究也為PERV變異特征及其機(jī)制研究提供線索。
　　 本研究在成功構(gòu)建我國五指山豬來源的PERV前病毒全基因克隆后，首次構(gòu)建并篩選獲得PERV感染性分子克隆，這對于闡明嗜人性PERV的生物學(xué)特性，探索PERV感染人源細(xì)