豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)、啟動(dòng)子活性分析及載體構(gòu)建.pdf

1、臨床上，供體器官的嚴(yán)重短缺，使人們將目光轉(zhuǎn)向了異種移植。到目前為止，豬被認(rèn)為是最適合的異種移植供體。但研究發(fā)現(xiàn)，以前病毒DNA形式整合進(jìn)豬體細(xì)胞基因組中的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)在體外能夠感染多種人源細(xì)胞，這引起了人們對(duì)異種移植安全性的廣泛關(guān)注。我國(guó)有著豐富的小型豬種資源，目前已經(jīng)開(kāi)展豬-人異種器官／組織移植的相關(guān)研究，但有關(guān)小型豬中PERV的攜帶、表達(dá)情況以及內(nèi)源性釋放

2、毒株的生物學(xué)特性方面報(bào)道甚少，因此有必要開(kāi)展這方面的研究工作，了解我國(guó)小型豬中PERV存在的本底，為異種器官受體提供安全可靠的器官，同時(shí)通過(guò)分析PERV 5’非編碼區(qū)的啟動(dòng)子活性，為進(jìn)一步研究PERV的生物學(xué)特性搭建技術(shù)平臺(tái)。另外，由于傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的過(guò)程中存在著包裝病毒的滴度較低以及某些病原的安全問(wèn)題，而基于PERV的長(zhǎng)末端重復(fù)序列構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體則有可能解決這些問(wèn)題，因?yàn)镻ERV是豬在進(jìn)化過(guò)程中獲得的反轉(zhuǎn)錄病

3、毒序列，每個(gè)細(xì)胞中PERV的拷貝數(shù)約為8-15個(gè)，尚未發(fā)現(xiàn)其致病性，并且由于在豬源細(xì)胞中有同源序列的存在，轉(zhuǎn)染載體至豬源細(xì)胞有可能獲得較高的包裝病毒滴度。目前國(guó)際上對(duì)PERV的研究均著眼于異種移植中其病原安全性的評(píng)價(jià)等方面，至今尚未見(jiàn)有利用其作為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的報(bào)道，因而，本研究也構(gòu)建了以PERV長(zhǎng)末端重復(fù)序列為調(diào)控序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本研究主要進(jìn)行以下三個(gè)方面的工作： 1．中國(guó)五指山豬中PERV存在與表達(dá)情況的調(diào)查

4、檢測(cè)分析豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)在中國(guó)五指山豬中的攜帶、表達(dá)情況。首先根據(jù)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所己建立的PCR、RT-PCR方法，應(yīng)用通用的env基因分型方法檢測(cè)PERV env-A、env-B、env-C在我國(guó)主要小型豬種之一的五指山豬基因組中的存在與表達(dá)情況。隨后又對(duì)五指山豬中PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在與表達(dá)進(jìn)

5、行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從病毒存在的情況看，我國(guó)五指山豬基因組中普遍存在PERV，其陽(yáng)性100％。PERV的存在以A亞型最高(97.01％)，其次為B亞型(94.03％)，此次未檢測(cè)到C亞型的存在；從病毒的表達(dá)情況看，PERV-B亞型的表達(dá)率高于A亞型，但所有的樣品均未檢測(cè)到PERV-C型的表達(dá)。從病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白的存在與表達(dá)情況看，五指山豬基因組中不僅存在PERVgag、pol、env特異性DNA，而且都能夠轉(zhuǎn)錄為RNA。由此說(shuō)明我國(guó)五指山

6、豬外周血淋巴細(xì)胞基因組中存在PERV-A、B 2種亞型，并且A、B兩種亞型均能夠表達(dá)。 2．對(duì)PERV 5’非編碼區(qū)啟動(dòng)子活性的分析 將缺失不同功能區(qū)的豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)5’非編碼區(qū)(5UTR)克隆至螢光素酶表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞COS-7，檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)，分析5UTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。結(jié)果表明：缺失R區(qū)的5’UTR顯示出很強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，U3重復(fù)區(qū)序列缺失的5’UTR啟動(dòng)子活性顯著下降。UTR顯示出

7、較之LTR強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。缺失整個(gè)U3區(qū)的UTR比僅缺失U3重復(fù)區(qū)的UTR啟動(dòng)子活性強(qiáng)。由結(jié)果分析得出以下結(jié)論：在R區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)可引起轉(zhuǎn)錄活性下降；U3重復(fù)區(qū)序列表現(xiàn)出增強(qiáng)子的活性。在5’UTR的下游序列中，包括引物結(jié)合區(qū)(PBS)和前導(dǎo)序列(Leader)可能有某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)可引起轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，同時(shí)在U3重復(fù)區(qū)的上游和下游序列可能存在某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)可降低5’UTR的轉(zhuǎn)錄活性。 3．基于PERV長(zhǎng)末端重復(fù)序

8、列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 采用PCR和酶切的方法以豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)替換逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIGRl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，構(gòu)建了以豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR為調(diào)控序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMP，并對(duì)此載體攜帶外源基因的能力及表達(dá)水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：pMP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞PK-15中能夠表達(dá)其所攜帶的外源基因neo，且表達(dá)水平略高于其原始載體pMIGRl。Southern blotting結(jié)果表明pM

9、P載體具有穩(wěn)定整合外源基因至PK-15基因組中的能力。由于pMP載體的構(gòu)建是整個(gè)PERV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建的部分工作，因此本研究也嘗試對(duì)pMP的被包裝能力作出相關(guān)評(píng)價(jià)。將在pMP多克隆位點(diǎn)處插入neo基因的pMPN和pMIGRl-5’UTR分別與pMIGRl的包裝系統(tǒng)pGAG-POL及pVSV-G共轉(zhuǎn)染HEK293-T細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞上清均未表現(xiàn)出感染性；轉(zhuǎn)染pMPN至PK-15細(xì)胞，其細(xì)胞上清檢測(cè)結(jié)果也為陰性。這些結(jié)果提示：異源