豬內源性反轉錄病毒的檢測、啟動子活性分析及載體構建.pdf

1、臨床上，供體器官的嚴重短缺，使人們將目光轉向了異種移植。到目前為止，豬被認為是最適合的異種移植供體。但研究發(fā)現，以前病毒DNA形式整合進豬體細胞基因組中的豬內源性反轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)在體外能夠感染多種人源細胞，這引起了人們對異種移植安全性的廣泛關注。我國有著豐富的小型豬種資源，目前已經開展豬-人異種器官／組織移植的相關研究，但有關小型豬中PERV的攜帶、表達情況以及內源性釋放

2、毒株的生物學特性方面報道甚少，因此有必要開展這方面的研究工作，了解我國小型豬中PERV存在的本底，為異種器官受體提供安全可靠的器官，同時通過分析PERV 5’非編碼區(qū)的啟動子活性，為進一步研究PERV的生物學特性搭建技術平臺。另外，由于傳統(tǒng)的逆轉錄病毒載體在介導基因轉移的過程中存在著包裝病毒的滴度較低以及某些病原的安全問題，而基于PERV的長末端重復序列構建的逆轉錄病毒載體則有可能解決這些問題，因為PERV是豬在進化過程中獲得的反轉錄病

3、毒序列，每個細胞中PERV的拷貝數約為8-15個，尚未發(fā)現其致病性，并且由于在豬源細胞中有同源序列的存在，轉染載體至豬源細胞有可能獲得較高的包裝病毒滴度。目前國際上對PERV的研究均著眼于異種移植中其病原安全性的評價等方面，至今尚未見有利用其作為逆轉錄病毒載體的報道，因而，本研究也構建了以PERV長末端重復序列為調控序列的逆轉錄病毒載體。本研究主要進行以下三個方面的工作： 1．中國五指山豬中PERV存在與表達情況的調查

4、檢測分析豬內源性反轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)在中國五指山豬中的攜帶、表達情況。首先根據軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所己建立的PCR、RT-PCR方法，應用通用的env基因分型方法檢測PERV env-A、env-B、env-C在我國主要小型豬種之一的五指山豬基因組中的存在與表達情況。隨后又對五指山豬中PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在與表達進

5、行檢測。結果發(fā)現：從病毒存在的情況看，我國五指山豬基因組中普遍存在PERV，其陽性100％。PERV的存在以A亞型最高(97.01％)，其次為B亞型(94.03％)，此次未檢測到C亞型的存在；從病毒的表達情況看，PERV-B亞型的表達率高于A亞型，但所有的樣品均未檢測到PERV-C型的表達。從病毒主要結構蛋白的存在與表達情況看，五指山豬基因組中不僅存在PERVgag、pol、env特異性DNA，而且都能夠轉錄為RNA。由此說明我國五指山

6、豬外周血淋巴細胞基因組中存在PERV-A、B 2種亞型，并且A、B兩種亞型均能夠表達。 2．對PERV 5’非編碼區(qū)啟動子活性的分析 將缺失不同功能區(qū)的豬內源性反轉錄病毒(PERV)5’非編碼區(qū)(5UTR)克隆至螢光素酶表達載體上，轉染瞬時表達細胞COS-7，檢測螢光素酶的表達，分析5UTR的轉錄調控規(guī)律。結果表明：缺失R區(qū)的5’UTR顯示出很強的啟動子活性，U3重復區(qū)序列缺失的5’UTR啟動子活性顯著下降。UTR顯示出

7、較之LTR強的啟動子活性。缺失整個U3區(qū)的UTR比僅缺失U3重復區(qū)的UTR啟動子活性強。由結果分析得出以下結論：在R區(qū)有轉錄因子的結合位點可引起轉錄活性下降；U3重復區(qū)序列表現出增強子的活性。在5’UTR的下游序列中，包括引物結合區(qū)(PBS)和前導序列(Leader)可能有某些轉錄因子的結合位點可引起轉錄增強，同時在U3重復區(qū)的上游和下游序列可能存在某些轉錄因子的結合位點可降低5’UTR的轉錄活性。 3．基于PERV長末端重復序

8、列的逆轉錄病毒載體的構建 采用PCR和酶切的方法以豬內源性反轉錄病毒(PERV)的長末端重復序列(LTR)替換逆轉錄病毒載體pMIGRl的轉錄調控序列，構建了以豬內源性反轉錄病毒的LTR為調控序列的逆轉錄病毒載體pMP，并對此載體攜帶外源基因的能力及表達水平進行了評價。結果表明：pMP在哺乳動物細胞PK-15中能夠表達其所攜帶的外源基因neo，且表達水平略高于其原始載體pMIGRl。Southern blotting結果表明pM

9、P載體具有穩(wěn)定整合外源基因至PK-15基因組中的能力。由于pMP載體的構建是整個PERV逆轉錄病毒載體系統(tǒng)構建的部分工作，因此本研究也嘗試對pMP的被包裝能力作出相關評價。將在pMP多克隆位點處插入neo基因的pMPN和pMIGRl-5’UTR分別與pMIGRl的包裝系統(tǒng)pGAG-POL及pVSV-G共轉染HEK293-T細胞，結果表明細胞上清均未表現出感染性；轉染pMPN至PK-15細胞，其細胞上清檢測結果也為陰性。這些結果提示：異源