小鼠αA晶體蛋白啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建以及啟動(dòng)子活性的檢測(cè).pdf

1、目的：克隆小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動(dòng)子活性片段，并構(gòu)建以小鼠αA-Crystallin基因啟動(dòng)子（αACP）驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）雙順反子特異表達(dá)載體，為白內(nèi)障基因治療藥物的開發(fā)提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：利用PCR技術(shù)，從小鼠總DNA上擴(kuò)增αA-Crystallin基因特異性啟動(dòng)子活性片段，應(yīng)用TA克隆技術(shù)構(gòu)建pMD19-T-αACP，克隆小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動(dòng)子活性片

2、段，并通過測(cè)序證實(shí)其克隆成功。利用基因重組技術(shù)將小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動(dòng)子活性片段（αACP）替換真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP上的CMV啟動(dòng)子，命名融合質(zhì)粒為pαACP-IRES2-EGFP，將其注射入大鼠幼鼠的晶狀體球后，在熒光顯微鏡下觀察晶狀體冰凍切片，通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)效果來驗(yàn)證啟動(dòng)子的活性。
　　 結(jié)果：通過pMD19-T-αACP融合質(zhì)粒的測(cè)序證實(shí)小鼠αA-Crystallin基因特

3、異性啟動(dòng)子活性片段（αACP）克隆成功，并構(gòu)建于pIRES2-EGFP質(zhì)粒中形成融合質(zhì)粒pαACP-IRES2-EGFP，對(duì)其融合質(zhì)粒上αACP基因片段行PCR擴(kuò)增、酶切圖譜分析獲得412bp的αACP目的條帶，經(jīng)測(cè)序鑒定與基因庫中（NC00083）小鼠αACP序列相比有99％的同源性，表明成功構(gòu)建了包含小鼠αA-Crystallin啟動(dòng)子活性片段（αACP）的特異表達(dá)載體pαACP-IRES2-EGFP，將其注射入大鼠幼鼠的晶狀體球后