抗BmNPV誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因干涉載體的構(gòu)建.pdf

1、家蠶核型多角體病是由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV)感染家蠶所引起的一種傳染性蠶病，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的主要病害，極大地危害了蠶業(yè)生產(chǎn)。提高家蠶品種對(duì)病毒的抵抗性和培育抗病品種是防治傳染性蠶病的有效措施。RNAi所介導(dǎo)的基因沉默能抑制病毒基因的復(fù)制，其與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合為培育抗病毒家蠶品種提供了新的方法。利用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子雖能提高RNAi效率，但是外源基因的組成性表達(dá)

2、對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶的發(fā)育會(huì)造成一定的影響。因此篩選合適的啟動(dòng)子，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)dsRNA的載體，在提高dsRNA表達(dá)水平的同時(shí)減少外源基因組成性表達(dá)的負(fù)荷，將為最終獲得具有BmNPV高度抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶育種素材奠定基礎(chǔ)。本文通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3對(duì)所選擇的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(plef3和p39k)進(jìn)行檢測(cè)，構(gòu)建了抗BmNPV誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因干涉載體。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的選擇與克隆
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)

3、道及桿狀病毒的級(jí)聯(lián)調(diào)控特征，對(duì)于BmNPV基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析，初步選擇并克隆了39k基因和lef3基因的啟動(dòng)子區(qū)域。測(cè)序結(jié)果顯示：所克隆的啟動(dòng)子均包含啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域，存在明顯的桿狀病毒啟動(dòng)子特征序列，含有TATA框，加帽位點(diǎn)，早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的保守序列(CAGT)，翻譯起始密碼子ATG等，序列上符合真核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn)。
　　 2、啟動(dòng)子活性檢測(cè)
　　 利用連接有BmNPV的39k及l(fā)ef3啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基

4、因重組載體pGL3-39k及pGL3-lef3轉(zhuǎn)染Sf9及BmE-SWU1兩種細(xì)胞，檢測(cè)了兩種啟動(dòng)子的活性。發(fā)現(xiàn)當(dāng)在AcMNPV及BmNPV兩種桿狀病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，均會(huì)誘導(dǎo)BmNPV的39k啟動(dòng)子的活性上調(diào)。在異源細(xì)胞Sf9中的組成型活性較低，但病毒感染后的誘導(dǎo)活性會(huì)大大提高(相對(duì)酶活由0.411提高到64.9268，感染后約為感染前的158倍)。同樣的，在宿主細(xì)胞BmE-SWU1被病毒感染后的39k啟動(dòng)子活性增加(相對(duì)酶活由6.0

5、151提高到12.6497，感染病毒后約為感染病毒前的2.103倍)。并且39k啟動(dòng)子活性在Sf9細(xì)胞中的組成型活性非常低，但在BmE-SWU1中組成型活性較高。而lef3啟動(dòng)子在有無(wú)病毒感染的情況時(shí)活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于39k啟動(dòng)子活性(P＜0.01)。進(jìn)一步在BmE-SWU1細(xì)胞中測(cè)定了39k啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活性，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，39k啟動(dòng)子的表達(dá)不斷提高且感染BmNPV的組中39k啟動(dòng)子的活性明顯高于未感染BmNPV的組中3

6、9k啟動(dòng)子的活性(P＜0.01)
　　 3、轉(zhuǎn)基因RNAi干涉載體的構(gòu)建及細(xì)胞水平上的抗病毒檢測(cè)
　　 分析確定了RNAi載體的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了可以在家蠶細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的雙鏈發(fā)夾狀RNA(hpRNA)的轉(zhuǎn)基因RNAi載體。進(jìn)一步利用抗生素G418對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因載體的家蠶細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，近4個(gè)月后建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，接種Bm-BacPAK6病毒后，檢測(cè)了病毒的增殖情況。研究表明：當(dāng)用較高的病毒濃度滴度(1.01