靛藍(lán)基因表達(dá)載體的構(gòu)建及香石竹CHS啟動子克隆研究.pdf

1、在觀賞植物中藍(lán)色花普遍偏少,用作觀賞的切花香石竹、郁金香、月季、玫瑰等都缺乏藍(lán)色花系.該論文從克隆花瓣特異表達(dá)的啟動子及與靛藍(lán)色素基因連接構(gòu)建表達(dá)載體等方面對藍(lán)色花基因工程育種進(jìn)行了一些研究,主要的研究內(nèi)容有以下幾個方面:(1)利用Genbank公布的兩個擬南芥查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)啟動子序列(AF248988和AF012810)設(shè)計序列特異性的引物,從擬南芥(Arabidopsisthialiana

2、,Columbia)基因組DNA中進(jìn)行PCR得到大小分別為533bp和2046bp的兩個啟動子片段(其中小片段啟動子是大片段啟動子的3'端部分),經(jīng)過克隆測序證明與Genbank中公布的序列超過99％的同源性.將小片段啟動子序列應(yīng)用PlantCARE軟件進(jìn)行分析,表明兩個序列均具有真核生物啟動子普遍具有的CAAT box和TATA box等保守序列,并且具有一些CHS啟動子特有的保守序列,證明兩個啟動子序列應(yīng)該具有相應(yīng)的啟動子活性.(2

3、)通過對兩個啟動子序列以及載體序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建,以應(yīng)用于以后的遺傳轉(zhuǎn)化研究.大、小兩個啟動子片段都分別與GUS基因或與Drewlo S等人從Ralstonia eutropha(真氧產(chǎn)堿桿菌)中克隆到的靛藍(lán)色素基因(bec基因)相連接,目的是分別用于鑒別相應(yīng)的啟動子活性和在觀賞植物中啟動靛藍(lán)色素基因的表達(dá).目前,小片段啟動子的兩個表達(dá)載體的構(gòu)建已經(jīng)完成,并進(jìn)行了煙草的初步轉(zhuǎn)化研究;大片段啟動

4、子載體的構(gòu)建正在進(jìn)行.(3)該課題的目的是得到能夠在觀賞植物中高效啟動靛藍(lán)色素基因表達(dá)的載體,但是考慮到擬南芥的CHS啟動子啟動靛藍(lán)色素基因在觀賞植物中的表達(dá)可能會受到種屬特異性等一些因素的影響而不能很好的啟動基因的表達(dá),該研究還進(jìn)行了從觀賞植物香石竹(Dianthus caryophyllus,Feraceseo)中克隆CHS啟動子的研究.由于到目前為止還沒有見到有關(guān)香石竹中CHS啟動子的報道,并且CHS啟動子具有很強(qiáng)的種屬特異性,在

5、不同種屬的植物之間具有很低的同源性,所以應(yīng)用CHS啟動子序列之間的同源性進(jìn)行香石竹CHS啟動子克隆的路線是不可行的.該文的研究通過CHS基因之間的同源性設(shè)計引物,從香石竹中進(jìn)行PCR并經(jīng)過克隆測序得到了三個CHS基因的5'端片段,經(jīng)過Blast分析證明了它們具有很高的同源性.然后利用銜接頭PCR的方法進(jìn)行了香石竹CHS啟動子克隆的初步研究,得到了約500bp和800bp的PCR產(chǎn)物,目前克隆測序工作正在進(jìn)行.進(jìn)一步的工作將進(jìn)行啟動子缺失