梨S-Rnase基因啟動(dòng)子克隆及雌雄不育植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、我國(guó)楊樹(shù)天然林約300萬(wàn)公頃,人工林約700萬(wàn)公頃,柳樹(shù)、懸鈴木、樟樹(shù)等園林綠化樹(shù)種也分布幾乎遍及全國(guó),大量植源性污染如飛毛飛絮、果毛、紫黑色漿果等對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了極大的污染,也對(duì)人體健康如皮膚過(guò)敏、鼻塞、流涕、咳嗽、甚至引發(fā)哮喘、過(guò)敏性鼻炎等造成嚴(yán)重的影響。減輕植源性飛毛飛絮污染的有效途徑之一是利用基因工程手段來(lái)培育雄性不育、雌性不育或雌雄均不育的楊柳樹(shù)、懸鈴木、樟樹(shù)等園林綠化樹(shù)種新品種,其中雄性不育不能完全有效控制植源性污染,而雌性不育

2、及雌雄均不育園林綠化樹(shù)種因不產(chǎn)生花粉、種子或果實(shí),即可有效控制植源性污染。梨雌蕊S-RNase基因在雌蕊中特異表達(dá),其啟動(dòng)子為雌蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子。為了解決上述飛毛飛絮污染問(wèn)題,本研究對(duì)雌蕊特異表達(dá)S-RNase基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆,并此基礎(chǔ)上構(gòu)建了雌性不育植物表達(dá)載體和雌雄不育植物表達(dá)載體,為培育雌性不育或雌雄均不育園林綠化樹(shù)種提供了有用的分子工具。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、采用TAIL-PCR擴(kuò)增梨S12-、S13-、S21

3、-RNase基因5’端上游側(cè)翼序列,長(zhǎng)度分別為1448bp,854bp,1137bp,分別命名為PpS12pro(HM047239)、PpS13pro(HM047240)、PbS21pro(HM047241)。PLACE和PlantCARE對(duì)其進(jìn)行順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),三個(gè)5’端上游側(cè)翼序列均具有典型TATA box和CAAT box,且上游均存在光應(yīng)答調(diào)控元件(Box4,G-box)、脫落酸應(yīng)答元件ABRE及水楊酸應(yīng)答元件TCA-el

4、ement等。根據(jù)砂梨S12-RNase基因5’端上游側(cè)翼序列調(diào)控元件設(shè)計(jì)一系列5’端缺失片段,并連接到pBI101.2載體的SalⅠ與XbaⅠ酶切位點(diǎn)之間與GUS基因融合,成功構(gòu)建了6個(gè)S12-RNase基因啟動(dòng)子植物表達(dá)載體PpS12pro-0-pBI101.2～PpS12pro-5-pBI101.2,Floral Dip法轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥,卡那霉素抗性平板篩選并PCR檢測(cè)分別得到了4、48、17、19、10、19株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基

5、因植株及2、13、8、10、7、12株轉(zhuǎn)基因純合體植株,用于進(jìn)一步驗(yàn)證該啟動(dòng)子的表達(dá)功能。
　　 2、利用花椰菜品種‘綠嶺’基因組DNA克隆了花藥絨氈層特異BoA9基因啟動(dòng)子和類細(xì)胞毒素用途的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1。以PpSlepro-pBI101.2為基礎(chǔ),在砂梨S12-RNase基因啟動(dòng)子下游XbaⅠ與XmaⅠ酶切位點(diǎn)之間插入半胱氨酸蛋白酶基因CysP1,構(gòu)建了雌性不育植物表達(dá)載體PpS12pro-CysP1-pBI1