小麥germin基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、近年來(lái)由于基因克隆技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步,使得通過(guò)基因工程方法改善作物的抗病性成為了可能.谷類(lèi)作物真菌病原菌常導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)而給農(nóng)民帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失.一般來(lái)說(shuō)抗真菌轉(zhuǎn)基因的目標(biāo)是加固植物細(xì)胞壁和產(chǎn)生抗真菌蛋白以直接或間接抑制真菌生長(zhǎng).有些植物病原菌真菌能分泌大量草酸,而草酸能導(dǎo)致組織腐爛,是致病過(guò)程中的關(guān)鍵因子.小麥中的germin是含有Mn離子的同源六聚體,具有草酸氧化酶活性,可將草酸氧化生成H<,2>O<,2>,在發(fā)育和防御過(guò)程中

2、起了重要作用.因此將草酸氧化酶基因?qū)胍赘胁〉淖魑镏芯褪轻槍?duì)真菌分泌的草酸的抗病基因工程最新認(rèn)識(shí).該研究的目的是獲得小麥germin基因并構(gòu)建植物表達(dá)載體,為轉(zhuǎn)germin基因研究提供基礎(chǔ).主要結(jié)果如下:1.小麥germin基因的克隆與序列分析小麥germin具有較強(qiáng)的草酸氧化酶活性.根據(jù)GenBank中的germin gf-2.8同源序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,從湘麥13基因組DNA中得到了長(zhǎng)度為812bp的目的片段,將PCR產(chǎn)物克

3、隆到pDive載體上并測(cè)序.將這一序列在NCBI-BLAST上進(jìn)行同源性比較,結(jié)果與germin gf-2.8的堿基序列同源性為90％.氨基酸序列的同源性為96％,其中有九個(gè)氨基酸不同,但基本上為同等氨基酸,并且符合germin中三組氨酸和一谷氨酸的草酸氧化酶活性位點(diǎn)的同源模型特征.2.Germin基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建將中間載體上的germin基因片段用BamHⅠ酶切下來(lái),插入用同樣酶切的雙元表達(dá)載體pBI121上,以菌落PCR篩選重

4、組子.對(duì)這些重組子用HindⅢ酶切以進(jìn)行正反方向檢測(cè),所有重組子酶切都得到一大片段和一小片段.但反向克隆的重組子得到的小片段大小為1,567bp,正向克隆的重組子所得的小片段大小為968bp,并命名正向克隆的重組子為pBG128.將pBG128用電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404,并進(jìn)行了菌落PCR驗(yàn)證.3.GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)入pBG128根癌農(nóng)桿菌LBA4404培養(yǎng)到OD600值為0.3-0.4,用乙酰丁香酮進(jìn)行誘導(dǎo)激活,然后與W