植物克隆載體pUC38的構(gòu)建和植物組成型表達(dá)抗凍肽基因的載體構(gòu)建及對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化.pdf

1、內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文植物克隆載體pUC38的構(gòu)建和植物組成型表達(dá)抗凍肽基因的載體構(gòu)建及對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化姓名：朱曄榮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物指導(dǎo)教師：達(dá)來(lái)2001.6.1植物克隆載體p U C 3 8 的構(gòu)建和植物組【成型表達(dá)抗凍肽基因的載體構(gòu)建墾塑望塑壁，匕一、引 言抗凍肽或抗凍蛋白( A m i f f e e z eP r o t e i n ，以下總稱A F P s ) 是一類(lèi)抑制冰晶生長(zhǎng)的蛋白，能以非依數(shù)形式降低水溶液的冰點(diǎn)

2、，對(duì)熔點(diǎn)影響甚微，從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值，該差值稱熱滯活性I l 】。自從1 9 7 6年，H e w 等從生活在北美海域的美洲擬鰈血清中分離出這種具有熱滯活性的熱滯蛋白以來(lái)，不但已經(jīng)在魚(yú)類(lèi)發(fā)現(xiàn)五類(lèi)A F P s ，而且在很多細(xì)菌、真菌、越冬節(jié)肢動(dòng)物及植物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)A F P s ，說(shuō)明A F P s 在生物界普遍存在，在生物適應(yīng)低溫生存中起著重要的作用。目前已在多種植物體內(nèi)提取純化出A F P s [ 2 —1 ，并且

3、克隆到植物內(nèi)源A F P s 基因【4 ～l 。隨著對(duì)其研究的展開(kāi)，加上轉(zhuǎn)基因植物和植物冷誘導(dǎo)研究的深入，為摸索植物的抗凍生理，進(jìn)而為提高植物的抗寒性提供了基礎(chǔ)。1 9 9 2 年本實(shí)驗(yàn)室從加拿大引進(jìn)了冬鰈A F P 的e D N A 克隆p C T 5 { 6 J 。經(jīng)P C R 擴(kuò)增的抗凍肽基因構(gòu)建到雙元載體p G A 6 4 3 中，并轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)冬鰈抗凍肽基因的表達(dá)并不理想【78 1 。對(duì)冬鰈A F P 結(jié)構(gòu)分析，推測(cè)可能與其

4、自身特性有關(guān)，所以我們根據(jù)有利于在植物中表達(dá)的特點(diǎn)，對(duì)冬鰈A F P 基兇進(jìn)行改造，特設(shè)計(jì)合成了帶有甘薯( I p o m o e ab a t m a s ) 塊根主要貯藏蛋白S p o r a m i n A 信號(hào)肽的抗凍肽基因單體、四聯(lián)體和八聯(lián)體。并將它們分別克隆在p G E M ．3 z f f ．) 載體中，經(jīng)測(cè)序證實(shí)合成及構(gòu)建成功【9 J 。我們?cè)趯?duì)抗凍肽基因進(jìn)行改造的同時(shí)，也在考慮構(gòu)建有利于植物中高效表達(dá)的載體。本室已成功

5、構(gòu)建了在大豆熱休克啟動(dòng)區(qū)P 0 5 p 調(diào)控下，與G U S 融合表達(dá)的抗凍肽基因的誘導(dǎo)型表達(dá)載體【l 0 1 ，以研究抗凍肽基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)區(qū)調(diào)控下表達(dá)的條件。本實(shí)驗(yàn)是構(gòu)建組成型表達(dá)載體。以雙元表達(dá)載體p B i n 4 3 8 來(lái)構(gòu)建，但我們對(duì)于p B i n 4 3 8 來(lái)說(shuō)，只知道拷貝數(shù)低，分子量較大，約有1 4 k b ，不容易操作，在R B 和L B 序列間有N P T I I 、C a M V 3 5 S 啟動(dòng)區(qū)和n o