GhCEL基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、纖維素是世界上最豐富、具有巨大商業(yè)價(jià)值的生物多聚體，幾十年來(lái)一直是人們研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，關(guān)于纖維素的生物合成及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的研究取得較大的進(jìn)展，這對(duì)于植物纖維素的生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室利用一個(gè)與擬南芥中的KOR基因(編碼跨膜內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶)高度同源的棉纖維的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags，EST)，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR篩選方法從陸地棉(Gossypiumhir

2、sutumL.)纖維cDNA文庫(kù)中分離出了它的全長(zhǎng)序列(GhCEL，GenBankaccessionnumber：AY574906)。在此工作基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了GhCEL基因植物表達(dá)載體，導(dǎo)入模式植物煙草中，并分析了轉(zhuǎn)化植株的纖維素含量的變化。 植物表達(dá)載體的構(gòu)建：通過(guò)特異引物設(shè)計(jì)從克隆載體上擴(kuò)增出目的基因GhCEL全長(zhǎng)序列，并引入到中間載體SK-pBlueScript+。從pFGE5941載體中引入CaMV35啟動(dòng)子序列，構(gòu)

3、建pCAMBIA1302：CaMV35。將中間載體SK-pBlueScript+：GhCEL中的目的基因片段連接到pCAMBIA1302：CaMV35上，即構(gòu)建了GhCEL基因與綠色熒光蛋白基因(GFP)融合的GhCEL基因的植物表達(dá)載體。 GhCEL基因轉(zhuǎn)化煙草：利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，將侵染過(guò)含有目的基因農(nóng)桿菌的煙草葉盤置于MS共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)置于含潮霉素(25mg·L-1)和頭孢霉素(500mg·L

4、-1)的MS選擇培養(yǎng)基中。同時(shí)設(shè)未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的葉盤置于MS選擇培養(yǎng)基中作對(duì)照。取葉盤周圍產(chǎn)生的愈傷組織，在MS繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，待芽長(zhǎng)至約3cm時(shí)，將芽切下轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基中，同時(shí)以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的不定芽作對(duì)照。將生根后的幼苗移入土壤中栽培，獲得了一批具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化植株。 取抗性植株葉片，按CTAB法提取煙草基因組DNA，并以其為模板用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照。結(jié)果表明，73.3％的抗性植株能擴(kuò)增

5、出360bp的特異帶，而未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株未見(jiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增帶。進(jìn)一步PCR-Southern雜交表明，陽(yáng)性植株都有明顯的陽(yáng)性雜交信號(hào)而陰性對(duì)照無(wú)雜交信號(hào)，證明了GhCEL基因已整合到了煙草基因組中。 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株纖維素含量測(cè)定結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化植株纖維素平均含量為22.32％，對(duì)照植株纖維素平均含量為17.10％。轉(zhuǎn)化植株纖維素平均含量比對(duì)照植株高5.22％。說(shuō)明GhCEL基因的表達(dá)促進(jìn)了纖維素生物合成。這為將GhCEL基因應(yīng)用于其