番茄DR1基因植物超表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、DR基因是通過差異顯示PCR法從番茄中分離的果實成熟新基因,屬于生長素反應(yīng)基因家族(Aux/LAAs).DR基因在果實發(fā)育和成熟過程中,其表達(dá)受乙烯和生長素的調(diào)節(jié),預(yù)示該基因不僅與果實成熟過程相關(guān),并且可能參與生長素與乙烯之間的相互作用.但目前對其作用機制并不清楚,該論文擬通過在番茄中超表達(dá)DR1基因研究其對果實成熟和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,從而明確DR1基因作用的分子機理.主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:一、物雙元超表達(dá)載體pBIN19-DR1的

2、構(gòu)建.1、異硫氰酸胍-酚-氯仿的方法從綠熟番茄果實中提取總RNA;2、以總RNA為模板,體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,用高保真pfu聚合酶通過PCR擴增了全長DR1基因;3、pfu擴增的DR1基因與經(jīng)SmaI酶切的pDH51載體通過T4 DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,用PCR方法篩選陽性菌落,陽性菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,該質(zhì)粒經(jīng)進一步PCR以及酶切鑒定確為重組中間載體質(zhì)粒,且外源片斷正向插入,命名為pDH5

3、1-DR1;4、中間載體pDH51-DR1經(jīng)EcoRI酶切獲得了包含35S啟動子、DR1基因、35S終止子的片段,此片段與經(jīng)EcoRI酶切的pBIN19質(zhì)粒連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,PCR篩選陽性菌落,陽性菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,該質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR鑒定確為重組植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒,命名為pBIN19-DR1.二、再生番茄植株的獲得.1、植物雙元表達(dá)載體pBIN19-DR1通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C55,用PCR篩選獲得了含表達(dá)載體的重組

4、農(nóng)桿菌菌落,該重組菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切進一步驗證了表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌;2、AlisaCring番茄種子無菌萌發(fā)獲得無菌苗,切取0.5cm下胚軸或0.4×0.6大小幼嫩子葉作為外植體;3、外植體置于芽再生培養(yǎng)基經(jīng)28℃暗室預(yù)培養(yǎng)三天,用轉(zhuǎn)化的工程農(nóng)桿菌液侵染30min,置于芽再生培養(yǎng)基28℃暗室共培養(yǎng)兩天,轉(zhuǎn)入含500mg/L Carb的抑菌培養(yǎng)基抑菌培養(yǎng)一周,再在含50mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基篩選重組子