番茄藍(lán)光受體CRY1和CRY2基因沉默和過(guò)量表達(dá)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因番茄研究.pdf

1、對(duì)于隱花色素的研究，在植物中主要是集中在對(duì)擬南芥的研究上，番茄隱花色素的研究目前有兩篇報(bào)道，一篇是對(duì)CRYl的CCT進(jìn)行反義操作后發(fā)現(xiàn)在藍(lán)光下轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了長(zhǎng)胚軸，在紅光下卻沒(méi)有這樣的表型?；ㄇ嗨販p少，而葉綠素和二級(jí)向光性曲率卻沒(méi)有發(fā)生變化。另一篇?jiǎng)t是對(duì)CRY2的過(guò)量表達(dá)，無(wú)論是在弱藍(lán)光還是強(qiáng)藍(lán)光下其節(jié)間都變短了，并且其葉子花青素和葉綠素含量同果實(shí)中的類黃酮和番茄紅素含量都增加了。并且花期推遲，葉腋的分枝變得發(fā)達(dá)。本研究主要是通過(guò)構(gòu)

2、建番茄藍(lán)光受體CRY1和CRY2基因基因沉默和過(guò)量表達(dá)植物表達(dá)載體，并以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，以得到轉(zhuǎn)基因植株。為進(jìn)一步研究番茄隱花色素的功能，特別是對(duì)與番茄紅素調(diào)控有關(guān)的基因功能進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 本研究共分兩部分：(1)番茄藍(lán)光受體CRY1和CRY2基因基因沉默和過(guò)量表達(dá)植物表達(dá)載體的構(gòu)建。通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建了pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB—CRY10X，DHB—CRY2RNA

3、i，pBI121fsp—CRY20X共五個(gè)植物表達(dá)載體。此部分內(nèi)容主要包括以下研究：①提取番茄總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得有關(guān)cDNA；②設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到用于構(gòu)建載體所需的帶有特異限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的基因片斷；③對(duì)于RNAi表達(dá)載體，需要先構(gòu)建到中間表達(dá)載體pSK上；④對(duì)于RNAi植物表達(dá)載體，通過(guò)BamH I和Sac I對(duì)連接在中間載體pSK上的重組子進(jìn)行雙酶切再連接到經(jīng)同樣雙酶切的pHB和pBI121fsp植物雙元載體質(zhì)粒上。而對(duì)

4、于過(guò)量表達(dá)載體則直接利用帶酶切位點(diǎn)的引物對(duì)PCR產(chǎn)物直接用于植物表達(dá)載體連接。pHB質(zhì)粒是受CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，pBI121fsp質(zhì)粒則是受番茄中一個(gè)在果實(shí)中特異表達(dá)基因(Lefsm1)的啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。⑤連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組子被命名為pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB-CRY10x，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X。⑥通過(guò)凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105

5、中。經(jīng)酶切鑒定及PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示重組植物表達(dá)載體pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X已成功構(gòu)建，基因分別正確插入到載體pHB中CaMV35s啟動(dòng)子與Nos3'轉(zhuǎn)錄終止子和pBI121果實(shí)特異啟動(dòng)子與Nos3'終止子之間的多克隆位點(diǎn)中。(2)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄的研究。以根癌農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法將基因?qū)敕选０?項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研

6、究：①植物材料的準(zhǔn)備。以10％次氯酸鈉溶液消毒番茄種子，發(fā)芽后取6～8天齡子葉做預(yù)培養(yǎng)；②根癌農(nóng)桿菌接種于含Rif(20mg/L)及Kin(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。③根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)質(zhì)粒pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X。pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X轉(zhuǎn)化番茄子葉，轉(zhuǎn)化通過(guò)農(nóng)桿菌與切成小塊的番茄子葉共培養(yǎng)、分化選擇