Bt殺蟲(chóng)基因cry7、cry8的鑒定及表達(dá).pdf

1、蘇云金芽胞桿菌，為芽胞桿菌屬，是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的一種革蘭氏陽(yáng)性菌，作為一種環(huán)保型的殺蟲(chóng)劑被廣泛用于害蟲(chóng)的防治，其產(chǎn)生的蛋白可以對(duì)多種害蟲(chóng)有高效的殺蟲(chóng)活性。蘇云金芽胞桿菌被認(rèn)為是化學(xué)農(nóng)藥的一個(gè)有效的替代品。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，蘇云金芽胞桿菌也成為轉(zhuǎn)基因作物抗蟲(chóng)基因的主要來(lái)源。因此，尋找新的殺蟲(chóng)活性基因?qū)οx(chóng)的防治具有重要意義。由于鞘翅目葉甲科害蟲(chóng)的危害日益嚴(yán)重，因此篩選出對(duì)其有高活性的菌株和基因具有重要意義。
　　本研究的主

2、要內(nèi)容如下:(1)本研究從海南地區(qū)的土壤中分離得到423株蘇云金芽胞桿菌，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法鑒定其菌株的基因型和殺蟲(chóng)晶體蛋白的成分。經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示其中23株菌中含有cry7Ab基因，片段大小為3417 bp。對(duì)含有cry7Ab基因的BJH705（GenBank登錄號(hào)為KX010669）菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的蛋白表達(dá)及生物活性測(cè)定。SDS-PAGE結(jié)果顯示該菌株可以表達(dá)分子量約為13

3、0 kDa的殺蟲(chóng)晶體蛋白。對(duì)大猿葉甲進(jìn)行生物活性測(cè)定，復(fù)篩結(jié)果顯示，該蛋白對(duì)大猿葉甲有較高的殺蟲(chóng)活性其LC50為53.386μg/mL。(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株3-1-a進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)其中含有cry8基因，進(jìn)一步用全長(zhǎng)引物進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果顯示該菌株同時(shí)含有cry8Ax和cry8Ea基因。與pEB表達(dá)載體連接，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，cry8Ax和cry8Ea基因可以在大腸桿菌中分別表達(dá)分子量為80

4、kDa、130 kDa的殺蟲(chóng)蛋白。序列已提交GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)分別為KU986725，KU955850。以大猿葉甲二齡幼蟲(chóng)為供試?yán)ハx(chóng)對(duì)兩種蛋白進(jìn)行生物活性初步測(cè)定，校正死亡率分別為56.89％，77.87％，利用80 kDa的蛋白進(jìn)行復(fù)篩，其LC50值為83.329μg/mL。
　　本研究針對(duì)我國(guó)海南地區(qū)和實(shí)驗(yàn)室保存菌株開(kāi)展了菌株篩選與殺蟲(chóng)基因克隆的研究，獲得有效新菌株BJH705和3-1-a，克隆有效殺蟲(chóng)基因3個(gè)，研究結(jié)