蘇云金芽孢桿菌的cry1Ac31和cry39-like基因鑒定及功能的研究.pdf

1、本課題對(duì)32株蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)通過(guò)鏡檢、SDS-PAGE分析、PCR-RLFP、生物殺蟲(chóng)活性測(cè)定等方法進(jìn)行了Bt菌株蛋白和基因型的鑒定，結(jié)果表明，32株Bt菌株中，有25株含有cry1Ac基因，表達(dá)約130kDa的晶體蛋白，有1株可能含有cry39基因，表達(dá)約75kDa的晶體蛋白；另外有4株表達(dá)蛋白大小約為130kD和2株表達(dá)蛋白大小約為140kDa，其基因型尚不能確定，有待進(jìn)一步分析

2、。選取其中6株進(jìn)行生物測(cè)定表明，產(chǎn)菱形晶體含有cry1Ac基因的4株(S3299-1、S3136-1、S3225-1、S3276-1)對(duì)鱗翅目小菜夜蛾幼蟲(chóng)有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，產(chǎn)方形晶體菌株S3060-1對(duì)淡色庫(kù)蟻和白紋伊蚊有很好的毒殺活性。
　　 蘇云金芽孢桿菌S3299-1是從中國(guó)海南島吊羅山熱帶雨林區(qū)的土壤樣品中分離得到的，通過(guò)PCR-RFLP方法鑒定出該菌株含有cry1Ac基因，然后用PCR方法克隆基因完整的ORF序列，測(cè)序

3、表明該基因編碼區(qū)(ORF)為3537 bp，編碼1178個(gè)氨基酸，其分子量約為130kDa，等電點(diǎn)為5.03，為弱酸性蛋白。序列比較結(jié)果表明，該基因與cry1Ac類(lèi)基因高度同源（同源性達(dá)99％），已在GeneBank中登錄，登錄號(hào)為：GU446674，被國(guó)際Bt毒素命名委員會(huì)命名為cry1Ac31。該基因插入表達(dá)載體pQE30Xa實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌異源表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)cry1Ac31蛋白大小為130kDa，其表達(dá)蛋白對(duì)小菜蛾的

4、殺蟲(chóng)活性LC50為2.204ng/ml。蘇云金芽孢桿菌S3060-1是從中國(guó)東北的黑龍江省涼水自然保護(hù)區(qū)土壤中分離出得到，經(jīng)PCR方法鑒定出該菌株可能含有新型cry39基因，通過(guò)SDS-PAGE分析該菌株產(chǎn)生晶體蛋白大約75kDa，生物測(cè)定表明，對(duì)淡色庫(kù)蚊和白紋伊蚊的殺蟲(chóng)活性LC50分別為43.833ng/ml和50.846ng/ml。通過(guò)改良的轉(zhuǎn)化子池質(zhì)粒DNA文庫(kù)篩選方法，篩選出一個(gè)含有該基因的陽(yáng)性克隆子pBU-X，該克隆子插入片段