蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白分離純化及其增效研究.pdf

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白分離純化及其增效研究姓名：韓嵐嵐申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：昆蟲學(xué)指導(dǎo)教師：趙奎軍張杰2002.6.1一!i!查些查蘭堡主笙苧蔓墨童莖塑莖墮!迫墨旦坌苧絲些墨苧堡苧竺!!一如60kDa的多肽，與前人報(bào)道相符。這幾種蛋白在50raMNa2C03和20mM乙醇胺。DH：100)溶液中消化的結(jié)果相同，只是在20InlVl乙醇胺(pH=10O)溶液中消化后的得奉相對(duì)低～些。莊LB液體培養(yǎng)基中，這幾株菌

2、株的生長(zhǎng)速率均較受體菌BL21(DE3)慢，可能由于了卦源基圍的大量表達(dá)影響了受體菌的正常生長(zhǎng)發(fā)育。在加入誘導(dǎo)劑IPTG2hrs后，這幾株蒲株先后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其順序?yàn)镃rylCa7、co，1Cb2、CDllel、CrylIa8，最遲進(jìn)入時(shí)數(shù)生長(zhǎng)期的是Cr5r2Ab4，并分別于12、16、竦HD73是在生長(zhǎng)4小時(shí)后進(jìn)八對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16、16、20hrs進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。而Bt菌12小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。2BtCry蛋白分離純化的研究研究

3、了Bt菌株和在Ecoli中BtCry蛋白的提取時(shí)機(jī)，先后分離純化了cD1Ca7、CnlCb2、cr、1lab、Cr、llel、Cry2Ab4蛋白和標(biāo)準(zhǔn)菌株Cr31Ac(HD一73)蛋白研究表明在Eccl，中表達(dá)的蛋白均在培養(yǎng)68hrs含量達(dá)到最高，CrylAc晶體蛋白則是在培養(yǎng)28—32hrs達(dá)到最高。將這幾種蛋白經(jīng)FPLC純化并進(jìn)行了活性分析表明CrylAc在5～6ml記的；屯脫峰活性較商而在cry基因Ecoli中表達(dá)產(chǎn)物則是在1肛l

4、lml處有較高的活性。3BtCry蛋白對(duì)棉鈴蟲幼蟲毒性的研究將上述6種cr、r蛋白對(duì)棉鈴蟲進(jìn)行初篩和兩兩正交組合的復(fù)篩，結(jié)果表明Cry1Ac和Cr2Ab4對(duì)棉鈴蟲的毒性較強(qiáng)，LC，o分別為315ug／ml和415ug／ml；CrylAcCr3’2Ab4組占的LC。為487ug／ml，兩者的共毒系數(shù)(CTC)為121，具有一定的增效作用。其余毒鬃對(duì)棉鈴蟲毒力的強(qiáng)弱依次是Cryllel、Crylla8、CrylCa7、CDrlCb2，這幾種

5、蛋白的蛆臺(tái)對(duì)棉鈴蟲沒有增效作用。4BtCry蛋白對(duì)玉米螟幼蟲毒性的研究將上述6種Cry蛋白對(duì)玉米螟進(jìn)行初篩和兩兩正交組合的復(fù)篩，結(jié)果表明CnrlAc、(nrllag、CDlIel對(duì)玉米螟有很強(qiáng)的活性將這三種蛋白進(jìn)行正交組合對(duì)玉米螟進(jìn)行生測(cè)，發(fā)脫C01Ac與COllel、05，lIa8分別有明顯增效作用、相加作用用校正死亡率進(jìn)行SAS舒析Cf)IAc、C07lla8、CO7llel、CrylAcCr5，lIel、Cry1AcCry1la8

6、的LCⅫ分別為：0134、0500、0223、O046、019Sug／g。CrylAcCr31Iel和CryIAcCr)rlla8蛋白組臺(tái)有顯著的增效作用，CTe分別為409和1(J6在LC”LC，s水平CDqAc的毒力最高。這些研究結(jié)果說明了CrylAc、Cryllel、CrylAcCr3llel以及Cr3，1AcCryllab蛋白組臺(tái)對(duì)玉米螟有很強(qiáng)的殺蟲活性，它們完全能取代已有的crylAb基因用于工程菌和抗蟲二程植物的構(gòu)建。同時(shí)也