蘇云金芽孢桿菌的重要功能基因.pdf

1、害蟲抗性問題已經成為蘇云金芽孢桿菌的重要研究課題。不少研究者在尋找新的蘇云金芽孢桿菌主要殺蟲基因-cry。PCR-RFLP技術已被證實可以快速分析鑒定蘇云金芽孢桿菌菌株的cry和cyt基因型。本研究在繼承前人已經成功建立的cry1-cry4、cry7、cry9和cry10鑒定體系基礎上，發(fā)展了cry5、cry6、cry8和cry11的PCR-RFLP鑒定體系，進而采用上述PCR-RFLP技術鑒定了蘇云金芽孢桿菌6株標準菌株和30株武夷山

2、分離株的cry1-cry11基因類型。結果發(fā)現(xiàn)，88.9％、61.1％和2.8％的菌株分別含有cry1、cry2和cry11類基因，從供試菌株中檢測到22種cry基因亞型(cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、cry1Db、cry1Ea、cry1Eb、cry1Fa、cry1Fb、cry1Ga、cry1Gb、cry1Ka、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ac、c

3、ry2Ad、cry2Ae和cry11Aa)。然而，所有供試菌株均未檢測到cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9和cry10基因型。第一代轉基因棉花主要含有cry1Ac。然而多種害蟲已經對蘇云金芽孢桿菌產生抗性，而鱗翅目重要害蟲小菜蛾在田間條件下已經對Cry1Ac產生了抗性。由于cry2Ab與cry1Ac序列同源性較低，兩者不大可能產生交互抗性，國外學者已經以cry2Ab基因為基礎獲得第二代轉基因棉花。目前，

4、蘇云金芽孢桿菌內毒素基因國際命名委員會網站(http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)共報道了7個cry2Ab基因和1個cry2Ad基因。本研究從武夷山分離株WB2和WB10中分別克隆到一個cry2基因(已被蘇云金芽孢桿菌內毒素基因國際命名委員會命名為cry2Ab8和cry2Ad2)。cry2Ab8全長1902bp，編碼633aa，所推導的氨基酸序列與已知的Cry2A

5、b基因氨基酸序列同源性最高達99.5％，與所有已知的Cry2Ab相比存在3個氨基酸的差異(Ala411Val、Ile629Leu和Ser630Pro)。cry2Ad2全長1902bp，編碼633aa，所推導的氨基酸序列與Cry2Ad1氨基酸同源性最高(99.4％)，有4個氨基酸的差異(Asn10Thr、Ser354Pro、Ile629Leu和Ser630Pro)。 蘇云金芽孢桿菌自1901年被發(fā)現(xiàn)以來，一直缺乏有效的抗病基因資源

6、。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)在蘇云金芽孢桿菌中存在一種抗病基因aiiA，其表達產物AiiA能減弱歐文氏菌導致的軟腐病危害。為了有效利用這種新型抗病基因資源，本研究利用PCR技術初步研究了aiiA基因在芽孢桿菌中的分布情況。結果表明：在5株蘇云金芽孢桿菌標準菌株、29株蘇云金芽孢桿菌武夷山分離株、3株蠟質芽孢桿菌標準菌株和1株枯草芽孢桿菌分離株中均含有aiiA基因。將來自3株蘇云金芽孢桿菌武夷山分離株、2株蠟質芽孢桿菌標準菌株和BS-1的aiiA

7、進行分子克隆。在線核苷酸序列BLAST分析結果表明：我們克隆到的aiiA基因與NCBI微生物基因組數(shù)據(jù)庫中的3株炭疽芽孢桿菌(GenBank登錄號AE017035、AE017334和AE017225)中的部分片段和其它已知的aiiA基因有95％-99％同源性。所克隆得到的aiiA基因推導的氨基序列比對結果表明，它們均含有2個已知相對保守的蛋白保守區(qū)103SHLHFDH109、165HTPGHTPGH173。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一個新的相對

8、保守的蛋白保守區(qū)187LLTIDASYT195。由于保守區(qū)一般位于酶構象中重要位點，有理由可以預測AiiA抗病性存在差異的根本原因在于保守區(qū)的差異。GST和來自枯草芽孢桿菌的aiiA基因的原核融合表達研究結果表明：來自BS-1的AiiA對歐文氏菌胡蘿卜亞種菌株Dya具有較明顯的防治效果。 研究者經常應用質粒載體進行基因工程菌的構建。然而由于外源質粒的不穩(wěn)定性，工程菌容易丟失外源基因。此外，多數(shù)質粒載體均含有對環(huán)境具有潛在安全性問

9、題的抗生素抗性基因。近年來，研究人員發(fā)展了一種新型的插入序列整合載體。這種載體可以把目的基因整合到受體菌的基因組上，而載體的余下部分則經高溫處理后從受體菌中消除。為了研究插入序列的特性，并嘗試利用其構建對環(huán)境友好的高效工程菌，本文檢測了131株蘇云金芽孢桿菌中的插入序列IS231。結果表明，20株供試蘇云金芽孢桿菌標準菌株均含有IS231,而在111株蘇云金芽孢桿菌中國分離株中也檢測到107株含有IS231。從9株標準菌株中克隆得到3個

10、新的插入序列IS231(IS231J、IS231O和IS231Q)、6個IS231異構體和1個新的移動插入盒(mobileinsertioncassette)MICBth4。有意思的是，在線BLAST結果表明，IS231J5'端495bp序列與已報道的vip1Ac基因(GenBank登錄號AY245547)3'端下游序列同源性高達99％。采用PHYLIP軟件(版本3.6b)的鄰位相連法和除權平均法分別構建和分析了IS231的進化樹。

11、 隨著2004年第一個蘇云金芽孢桿菌全基因組序列的公布，蘇云金芽孢桿菌功能基因組學的相關研究已成為一個新的研究趨勢。眾所周知，蘇云金芽孢桿菌在不同生長階段表達不同的毒力相關因子。為更好地了解蘇云金芽孢桿菌分化發(fā)育進程與其毒力的關系，本研究利用一種新型轉錄組學研究手段—任意引物PCR技術(RAP-PCR)檢測了蘇云金芽孢桿菌8010處于對數(shù)生長期、孢子期和裂解期5個不同時間點基因表達的差異，克隆并鑒定了15個可能差異表達基因的cDNA

12、片段。利用特異引物RT-PCR證實其中6個為真正的差異表達基因，分別與芽孢桿菌屬外孢囊蛋白、依賴于ATP的蛋白酶La、3-羥丁酰輔酶A脫水酶、苯醌氧化還原酶、尿苷激酶、3-甲基-2-氧代丁酸羥甲基轉移酶有很高的核苷酸序列同源性。這些蛋白多與蠟質芽孢桿菌芽孢形成和適應環(huán)境脅迫、物質合成和能量代謝有關。推測依賴于ATP的蛋白酶La的表達可能由環(huán)境脅迫誘導，并受到一個基因簇的調控。綜上所述，本研究獲得了一些重要的功能基因。在第2章，本研究完善

13、了前人cry基因鑒定體系，為新基因的發(fā)現(xiàn)、利用及高效廣譜菌株的快速篩選提供技術支持，獲得了兩個cry2新基因(cry2Ab8和cry2Ad2)。Cry2Ab已被證明對鱗翅目害蟲具有較高活性，而Cry2Ad的研究未見正式報道。因此，所獲得的兩個cry2新基因為構建基因工程菌和轉基因植物提供了良好的材料。通過第3章的研究，我們在aiiA基因中發(fā)現(xiàn)了一個未見報道的相對保守的區(qū)段187LLTIDASYT195。同時，在構建aiiA枯草芽孢桿菌工

14、程菌的過程中，發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌(內生亞種菌株BS-1)中存在aiiA基因，這個發(fā)現(xiàn)進一步豐富了枯草芽孢桿菌的抗病基因家族。BS-1aiiA基因測序結果、三維結構預測、原核表達和生物活性測定均表明它可以降低歐文氏菌胡蘿卜亞種導致的軟腐病危害程度。來自BS-1的aiiA基因不僅具有科學研究價值，也具有潛在的應用價值。在第4章，我們獲得了4個新的插入序列，這些工作為進一步構建插入序列整合載體提供了良好的條件，為構建高效抗病工程菌奠定了基礎。