蘇云金芽孢桿菌普魯蘭酶基因的鑒定.pdf

1、淀粉質(zhì)原料是迄今最為廣泛應(yīng)用的工業(yè)原料，淀粉酶是降解此類原料的一類酶，其中包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、解支酶等，特別是由于大量的支鏈淀粉的存在使得解支酶顯得更為的重要。但是由于種種的原因?qū)庵傅拈_(kāi)發(fā)利用規(guī)模還較小，所以近年來(lái)漸漸引起人們的關(guān)注。普魯蘭酶(EC3.2.1.41)，能夠?qū)Ｒ恍缘拇呋ф湹矸坌投嗵铅?1，6-糖苷鍵的水解，從而使支鏈淀粉型多糖的分支鏈脫離主鏈形成一系列鏈長(zhǎng)不一的直鏈淀粉。普魯蘭酶就是一種典型的解

2、支酶。普魯蘭酶的水解性質(zhì)就決定了它具有提高淀粉質(zhì)原料利用率、降低糧耗的作用，在淀粉加工工業(yè)中有著重要的用途和良好的市場(chǎng)前景。 本研究的目的是探索利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌系統(tǒng)來(lái)表達(dá)來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的普魯蘭酶基因。經(jīng)過(guò)序列分析可知蘇云金芽孢桿菌有兩段基因可能編碼普魯蘭酶，分別標(biāo)注為amyX和pulA。本文通過(guò)PCR的方法從蘇云金芽孢桿菌的染色體上擴(kuò)增得到此普魯蘭酶基因，通過(guò)測(cè)序鑒定與報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌konkukian亞種的

3、普魯蘭酶基因的序列完全一致。分別構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-amyX和pHSG-pulA分別在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中獲得了表達(dá)。通過(guò)酶活的測(cè)定在兩種重組菌中都檢測(cè)到了酶活。同時(shí)對(duì)重組芽孢桿菌所產(chǎn)的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)作了初步的研究。重組酶的最適作用pH值約6.5，pH6-8范圍酶較穩(wěn)定。最適作用溫度大約在50℃，40℃-70℃為酶的穩(wěn)定溫度范圍，同時(shí)將酶70℃保溫45min，仍然保持約50％的酶活力。對(duì)重組質(zhì)粒的穩(wěn)定考察發(fā)現(xiàn)pET-28a

4、-amyX在大腸桿菌中穩(wěn)定性較好，而對(duì)于芽孢桿菌表達(dá)載體pHSG-pulA在傳代過(guò)程中發(fā)生了質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，無(wú)選擇壓力下連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，幾乎全部發(fā)生丟失。 對(duì)重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的優(yōu)化，分別考察了碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量以及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)酶的影響。得到了最終的優(yōu)化培養(yǎng)基，其成分為：可溶性淀粉2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，NaCl1％，K2HPO40.017％，MgSO4·7H2O0.012％。MnSO4·7H