蘇云金芽胞桿菌殺蟲基因的鑒定與克隆.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前應用最廣泛的生防微生物。由于害蟲抗性的產生，殺蟲譜窄等問題的存在，蘇云金芽胞桿菌新型基因的克隆將為拓寬我國Bt殺蟲基因的種類，擴大殺蟲對象，特別是發(fā)現(xiàn)對較難防治的害蟲有效的基因，為培育抗蟲轉基因植物提供有效的基因資源，也為害蟲的抗性治理提供一種方法。本研究采用PCR-RFLP技術對本實驗室分離保存的285株Bt菌株進行了基因型的鑒定：結果表明這些菌株含有cry1，

2、cry2，cry3，cry4/10，cry8，cry9，cry11，cry21，cry22，cry30，cry32，cry40和vip3A共13類基因。56株含有cry1型基因,45株含有cry2型基因，97株含有cry8型基因，13株含有cry32型基因，10株含有cry4/10型基因，9株含有cry30型基因，5株含有cry22型基因，含有cry11和cry3型基因的菌株各2株，含有cry9，cry21和cry40型基因的菌株各1株

3、；有39株含有vip3A型基因；106株未鑒定出基因型，這些菌株有可能含有未知的基因型，有待于進一步研究。在基因組合方面，有12株含有cry8C和cry8F，5株含有cry8E和cry8F基因；發(fā)現(xiàn)有5株同時含有cry1Aa，cry1Ea，cry1Be，cry1Ah，cry1Ai，cry1Ic，cry2Ab和vip3Aa共8種基因，殺蟲活性也有待于進一步研究。
　　 伴胞晶體的SDS-PAGE分析結果表明：同時含有cry1和cr

4、y2型基因的菌株大部分表達約130kDa、60kDa的晶體蛋白，晶體形狀多為菱形；含有cry22基因的菌株編碼約80kDa蛋白,晶體為大圓形，且晶體較芽胞大；含有cry32基因的菌株多表達約130 kDa、40kDa的晶體蛋白，晶體形狀為菱形；含有cry8基因的菌株大部分表達約130kDa的蛋白條帶，晶體形狀幾乎都為球形。未鑒定出基因型的菌株表達的晶體蛋白多樣，晶體形狀也具有多樣性。
　　 從菌株FZ-4中克隆了全長cry22基

5、因。菌株FZ-4中克隆得到的全長cry22基因已在GenBank中登記，登錄號為EU715020，并被Bt基因國際命名委員會正式定名為cry22Aa3，是一種新的cry22基因，在國內首次發(fā)現(xiàn)。
　　 通過對cry4和cry32基因部分序列的克隆與測序，發(fā)現(xiàn)了4個新基因。菌株FBG-133和FZ-2各含有一個新的cry32基因，菌株FBG-133克隆的部分基因序列與GenBank中已知的Bt模式基因cry32Ca1（AB0754

6、61.1）的序列相似性最高，相似性為86％；菌株FZ-2中克隆的部分基因序列與Bt模式基因cry32Aa1（AY008143.1）的序列相似性最高，相似性為91％。菌株FBG-25經克隆得到1563 bp的部分基因序列，這部分基因序列只與已知的cry模式基因cry54Aa1(EU339367)具有序列相似性，相似性為97％。菌株FPT-3經克隆得到1418bp的部分基因序列，通過NCBI BLAST分析發(fā)現(xiàn)，克隆得到的部分基因序列與Ge

7、nBank中已知的Bt基因不存在相似性，推斷含有未知的基因，有待于進一步研究。
　　 97株含有cry8基因的菌株中有3株對大黑鰓金龜幼蟲活性較高，這3株菌分別為菌株Hw-11、FBG-74和FBG-17，LC50分別為1.0716×108芽胞/mL菌液、3.6109×108芽胞/mL菌液和11.5792×108芽胞/mL菌液；有44株對銅綠麗金龜幼蟲活性較高，其中菌株FPT-38和Hw-2對銅綠麗金龜的活性最高，14d校正死亡