蘇云金芽胞桿菌酪氨酸酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用初探.pdf

1、酪氨酸酶基因(mel)編碼的酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶.該酶催化底物L(fēng)-酪氨酸形成L-多巴,并經(jīng)一系列氧化過程合成黑色素.黑色素具有多種重要的生理功能,特別是其抗紫外線,清除自由基的功能和應(yīng)用價(jià)值倍受關(guān)注.由前人的研究結(jié)果已知蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)在酪素培養(yǎng)基42℃條件下產(chǎn)生可溶性棕黑色黑色素的基礎(chǔ)上,首先對(duì)該室保藏的近120余株蘇云金芽胞桿菌,其中包含約80個(gè)亞種和血清型,進(jìn)行了產(chǎn)黑色素

2、的普查.結(jié)果表明,約50﹪測(cè)試菌株均在酪素培養(yǎng)基42℃高溫誘導(dǎo)下產(chǎn)生黑色素,產(chǎn)生黑色素的時(shí)間和濃度隨菌株不同而有所差別.在NCBI網(wǎng)站上比較已克隆的各種生物酪氨酸酶蛋白質(zhì)氨基酸序列,得到其保守結(jié)構(gòu)域的區(qū)段(編號(hào)pfam00264.8),將該區(qū)段氨基酸序列在部分已測(cè)序的蠟狀芽胞桿菌ATCC10987總基因組中進(jìn)行tblastn分析,結(jié)果得到相似性最大的一段2.5kb的DNA序列.由于有人將蘇云金芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌已報(bào)道的基因序列進(jìn)行比

3、較發(fā)現(xiàn)二者的相似性高達(dá)98﹪,因此根據(jù)該2.5kb的DNA序列設(shè)計(jì)引物從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis 4D11)中擴(kuò)增得到了包含酪氨基酸酶基因的1.2kb大小的DNA片段.通過引物引入的SacI和BamHI酶切位點(diǎn)將該片段亞克隆到載體pGEM-7zf上獲得重組質(zhì)粒pBMB1179.將它轉(zhuǎn)入大腸桿工力DH5α,所得到的轉(zhuǎn)化子EMB1179在添加了0.1﹪L-酪氨酸的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時(shí)后能明顯合成

4、可溶性的黑色素.將如上條件下培養(yǎng)的EMB1179制備蛋白質(zhì)樣品并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果得到與預(yù)期酪氨酸酶分子量大小一致的約28.5KD的特異蛋白質(zhì)條帶.測(cè)定重組菌株EMB1179黑色素的產(chǎn)生隨時(shí)間變化曲線.結(jié)果表明,黑色素在菌體培養(yǎng)前6h內(nèi)生成量不大,在6~18h內(nèi)生成量逐漸增大,到18h達(dá)到峰值.與此同時(shí),將EMB1179在酪素?fù)u瓶37℃培養(yǎng)36h后在300nm紫外光下進(jìn)行照射,根據(jù)菌體存活率的大小,斷定給該mel基因產(chǎn)生的黑

5、色素確定能在一定程度上保護(hù)菌體免受紫外輻射.利用PCR片段重疊延伸連接技術(shù)(SOE),將蘇云金芽胞桿菌酪氨酸酶基因的編碼區(qū)前端加和蘇云金芽胞桿菌芽胞非依賴型強(qiáng)啟動(dòng)子pro3Aα,通過擴(kuò)增引入的SphI和SacI酶切位點(diǎn)將此融合片段構(gòu)建到穿梭載體pHT3101上獲得重組質(zhì)粒pHTPM.將此重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蘇云金芽胞桿菌無晶體突變受體菌株BMB171,得到轉(zhuǎn)化子BMBPM.在30℃酪素培養(yǎng)基中,重組菌重組菌BMBPM已經(jīng)能夠合成黑色素,但其