蘇云金芽胞桿菌新型殺蟲晶體蛋白基因的克隆及其功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)在形成芽胞的同時(shí)能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白。目前，對(duì)于Bt殺蟲晶體蛋白的研究主要集中在它的殺蟲機(jī)理及其與靶標(biāo)昆蟲的相互作用方面。隨著Bt殺蟲劑的長期使用，昆蟲對(duì)其產(chǎn)生的抗性受到人們的廣泛關(guān)注與深入研究。在多種抗性管理策略中，篩選新的Bt殺蟲菌株并挖掘殺蟲新基因以及通過基因工程技術(shù)構(gòu)建新型殺蟲毒素，已經(jīng)成為延緩害蟲對(duì)Bt殺蟲劑產(chǎn)生抗性的有效方法。
　　 利用本研究室

2、建立的聚丙烯酰胺凝膠包埋聯(lián)合質(zhì)譜檢測技術(shù)，分析了對(duì)蚊蟲具有高毒力的Bt杰加森亞種（Bt subsp.jegathesan）367菌株伴胞晶體的原毒素組成。結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)生的伴胞晶體含有8種原毒素(Cry11Ba、Cry19Aa、Cry24Aa、Cry25Aa、Cry30Ca、Cry60Aa、 Cry60Ba和Cyt2Bb)，其中3種(Cry30Ca、Cry60Aa和Cry60Ba)在該菌株中未曾報(bào)道。序列分析發(fā)現(xiàn)Cry30Ca和Cr

3、y60Aa的編碼序列為新基因（GenBank登錄號(hào)分別為GQ368655和GQ398500）。在Bt杰加森亞種367菌株中，這3種新發(fā)現(xiàn)原毒素的編碼序列呈現(xiàn)出cry30Ca-gap-orf2和cry60Ba-gap-cry60Aa的結(jié)構(gòu)特征。將其編碼基因克隆后分別在大腸桿菌BL21(DE3)及Bt無晶體菌株中實(shí)現(xiàn)了高量表達(dá)。在Bt無晶體菌株中單獨(dú)表達(dá)Cry30Ca時(shí)，其表達(dá)量很低且不能形成可見包涵體，當(dāng)與ORF2蛋白共表達(dá)時(shí)，Cry30

4、Ca的表達(dá)量提高5.9倍且能形成大的包涵體，這一結(jié)果表明ORF2蛋白對(duì)于Cry30Ca的穩(wěn)定表達(dá)具有重要作用。Cry60Aa和Cry60Ba在Bt無晶體菌株中單獨(dú)表達(dá)和共表達(dá)時(shí)，都能大量表達(dá)并形成明顯的包涵體。毒力生測結(jié)果表明，Cry60Aa和Cry60Ba在單獨(dú)作用和同時(shí)作用時(shí)均對(duì)致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）表現(xiàn)出一定的殺蟲活性，而Cry30Ca對(duì)該蚊蟲則沒有毒殺活性。
　　 來自Bt以色列亞種(B

5、t subsp.israelensis)的Cry11Aa毒素和Bt杰加森亞種的Cry11Ba毒素對(duì)蚊蟲具有很高的毒殺活性。為了研究Cry11Aa和Cry11Ba不同結(jié)構(gòu)域的功能，并通過在這兩個(gè)毒素之間進(jìn)行結(jié)構(gòu)域置換來構(gòu)建新型殺蟲蛋白，本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)在Cry11Aa與Cry11Ba的DomainⅠ和Ⅱ編碼序列的連接位置引入了ClaⅠ酶切位點(diǎn)及DomainⅡ和Ⅲ編碼序列的連接位置引入了AftⅡ酶切位點(diǎn)，由此構(gòu)建出6種雜合毒素:BAA

6、、ABA、AAB、ABB、BAB和BBA。在Bt無晶體菌株中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，除ABA和ABB外，其余4種雜合毒素均能獲取預(yù)期表達(dá)。將親本毒素和雜合毒素對(duì)埃及伊蚊(Aedes aegypti)及致倦庫蚊進(jìn)行生測，發(fā)現(xiàn)親本毒素Cry11Ba對(duì)以上兩種蚊蟲均表現(xiàn)出很高的殺蟲毒力，Cry11Aa與雜合毒素AAB對(duì)以上兩種蚊蟲均表現(xiàn)相似的中等毒力，而其它雜合毒素均沒有毒力。這一研究表明Cry11Ba的3個(gè)結(jié)構(gòu)域共存對(duì)于其毒力具有重要作用，而Cry11

7、 Aa的結(jié)構(gòu)域Ⅲ可以被Cry11 Ba的結(jié)構(gòu)域Ⅲ替換而不影響毒力。
　　 本研究從Bt杰加森亞種367菌株中檢測到了3種在該菌株中未被報(bào)道的原毒素，表明該菌株伴胞晶體的原毒素組成比以前所報(bào)道的組分更為復(fù)雜。由此我們推測，在已知Bt菌株中可能還有更多未被發(fā)現(xiàn)的毒素組分，這將對(duì)Bt菌株殺蟲潛力的挖掘以及搜尋新型殺蟲基因具有重要的指導(dǎo)作用。同時(shí)，對(duì)具有較強(qiáng)殺蚊效果的Cry11Aa和Cry11Ba進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域置換研究，證實(shí)了其各結(jié)構(gòu)域?qū)?/p>