蘇云金芽胞桿菌芽胞和晶體形成相關(guān)功能基因研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)作為一類微生物農(nóng)藥,因其殺蟲效果好、對人畜安全、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用,約占整個(gè)生物農(nóng)藥市場的90％。與芽胞桿菌屬其它種相比,Bt的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是在形成芽胞的同時(shí)能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白(ICPs)。枯草芽胞桿菌作為模式菌株,有關(guān)芽胞形成的機(jī)制研究相對深入,而針對Bt殺蟲晶體的形成機(jī)制的研究還主要集中于殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)調(diào)控,關(guān)于晶體和芽胞形成相關(guān)基因關(guān)系

2、的報(bào)道還很少。因此,本研究通過對功能基因組學(xué)相關(guān)方法的運(yùn)用。初步研究了蘇云金芽胞桿菌中分別位于染色體和質(zhì)粒上的兩個(gè)基因,并對它們對芽胞和晶體形成的作用加以闡述,這將有助于闡明Bt芽胞、晶體形成機(jī)制,為改造更為安全、高效的工程菌株提供理論依據(jù)。
　　 本研究利用攜帶Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的pIC333溫敏載體,完成了B.thuringiensisHD73的轉(zhuǎn)座子突變體庫的構(gòu)建,獲得了20,000株具有壯觀霉素抗性的突變體,并完成

3、了突變體庫的鑒定。經(jīng)過篩選,獲得兩株不能產(chǎn)生芽胞和晶體的突變株。通過對突變株轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列的分析,確定了插入位點(diǎn)分別位于染色體上copG基因和質(zhì)粒上尚無任何報(bào)道的一條基因(命名為11sc)內(nèi)部,分別造成了9個(gè)堿基的重復(fù),并研究了突變株產(chǎn)生芽胞、晶體的能力。因此,將突變株分別命名為HD73(copG)::Mini-Tn10和HD73(11sc)::Mini-Tn10。
　　 進(jìn)一步構(gòu)建了敲除copG部分和全部基因載體,分別命名為p

4、RN5101(copG△’)及pRN5101(copG△),將其分別導(dǎo)入HD73出發(fā)菌株,經(jīng)高溫誘導(dǎo)突變,篩選獲得了缺失相應(yīng)基因的突變株,分別命名為HD73(copG△)和HD73(copG△)。鏡檢結(jié)果顯示,雖然殺蟲蛋白的量較出發(fā)菌株少,但突變株依然有產(chǎn)生芽胞和晶體的能力。構(gòu)建敲除11sc全部基因載體pRN5101(11sc△),經(jīng)轉(zhuǎn)化、突變、篩選后獲得相應(yīng)突變株HD73(11sc△),但仍未喪失產(chǎn)生芽胞、晶體的能力。