蘇云金芽胞桿菌Y41新型cry基因克隆及其質(zhì)粒的分析.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)因其殺蟲(chóng)效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最為廣泛的殺蟲(chóng)微生物。它能在芽胞形成的同時(shí)，形成殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidalcrystalproteins，簡(jiǎn)稱(chēng)ICPs)。該蛋白由cry基因編碼，現(xiàn)已有多種cry基因和cyt基因被克隆和用于構(gòu)建殺蟲(chóng)遺傳工程菌株或轉(zhuǎn)基因植物，部分工程菌和轉(zhuǎn)基因植物已商品化。殺蟲(chóng)晶體蛋白有殺蟲(chóng)譜窄，殺蟲(chóng)活性低的缺點(diǎn)，而且部分害蟲(chóng)已經(jīng)產(chǎn)

2、生抗性。不斷分離高毒力的、無(wú)交叉抗性的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因是解決這些問(wèn)題的重要手段。 1.以蘇云金芽胞桿菌新菌株Y41為材料，進(jìn)行了晶體形態(tài)、蛋白分子量、質(zhì)粒圖譜分析，結(jié)果表明菌株Y41殺蟲(chóng)晶體蛋白在菌株中形成球形晶體，分子量多在140kD、70kD附近，而所含有的質(zhì)粒帶型與其它菌株相比非常簡(jiǎn)單，只有2條明顯的條帶。 2.根據(jù)菌株Y41殺蟲(chóng)晶體蛋白分子量以及晶體形狀特征，選擇了一組毒素基因進(jìn)行鑒定引物設(shè)計(jì)，建立了一個(gè)可以高效

3、分離到新型cry基因的PCR-RFLP鑒定系統(tǒng)。通過(guò)這個(gè)鑒定系統(tǒng)分離得到4個(gè)新cry基因片段。利用Fosmid文庫(kù)、通過(guò)測(cè)序步移、建立鳥(niǎo)槍法文庫(kù)方法，獲得了5個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，這些序列已經(jīng)提交GenBank，并且已經(jīng)獲得Bt毒蛋白國(guó)際命名委員會(huì)正式命名。其中3個(gè)屬于第二等級(jí)的新基因，2個(gè)屬于第一等級(jí)的基因。同時(shí)獲得了一個(gè)新cry基因的部分序列，通過(guò)BLAST比對(duì)分析，這個(gè)基因片段與cry50Aal有65％的一致性，屬于cry50類(lèi)的新基

4、因。 3.構(gòu)建了一個(gè)高效克隆表達(dá)載體pEB，提高了基因表達(dá)載體構(gòu)建效率。通過(guò)這個(gè)載體成功表達(dá)了toxin01，toxin02，toxin03，toxin04四個(gè)基因，但這4個(gè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)雙翅目害蟲(chóng)庫(kù)蚊沒(méi)有殺蟲(chóng)活性。測(cè)定了菌株Y41殺蟲(chóng)活性，結(jié)果顯示菌株Y41對(duì)小菜蛾、榆藍(lán)葉甲、猿葉甲、庫(kù)蚊無(wú)殺蟲(chóng)活性。 4.通過(guò)鳥(niǎo)槍法測(cè)序，獲得了Y41菌株小質(zhì)粒的pYl3536序列，并完成了相關(guān)的序列分析。 本研究通過(guò)PCR-RFL