蘇云金芽胞桿菌大質(zhì)粒pBMB165的克隆與分析.pdf

1、本論文以蘇云金芽胞桿菌為研究對象，克隆并繪制了質(zhì)粒pBMB165的物理圖譜，同時對蘇云金芽胞桿菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。 本文第一部分，以蘇云金芽胞桿菌擬步行甲亞種(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis，H<,8ab>)菌株YBT-1765為出發(fā)菌株，對其可檢測到的最大質(zhì)粒pBMB165進行克隆分析研究。通過對YBT-1765總質(zhì)粒和全基因組DNA

2、分別進行BamHI和HindlII不完全酶切，以pBeloBAC11為載體，成功構建了蘇云金芽胞桿菌YBT-1765的基因組的細菌人工染色體(BAC)文庫和質(zhì)粒的BAC文庫。根據(jù)已克隆的包含復制子oril65在內(nèi)的3.6kb片段(pBMB165-F4A)中編碼復制蛋白Rep165的核苷酸序列設計探針，通過染色體步移方式進行篩選。在對質(zhì)粒文庫進行篩選時，得到5個具有重疊關系的克隆子，測定這些克隆子的末端序列。根據(jù)這些末端序列設計引物，通過

3、染色體步移方式，對YBT-1765的基因組BAC文庫進行篩選，獲得8個覆蓋質(zhì)粒pBMBl65不同區(qū)域的克隆子。測定這8個陽性克隆子的末端序列，序列結果顯示它們之間存在著重疊群，并且能夠覆蓋整個質(zhì)粒pBMB165。通過對上述13個克隆子進行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析，建立了質(zhì)粒pBMB165的物理圖譜和線狀重疊連鎖圖，并測算出該質(zhì)粒的大小為82kb。對其中一個陽性克隆pBMB165A2作了序列測定：根據(jù)部分核苷酸序

4、列初步統(tǒng)計了pBMB165上轉(zhuǎn)座因子的存在機率，在pBMB165A2上轉(zhuǎn)座因子存在的機率值為40.5％，說明pBMB165中存在豐富的轉(zhuǎn)座因子，YBT-1765菌株基因組文庫的構建和物理圖譜的繪制為克隆蘇云金芽胞桿菌大質(zhì)粒提供了一套可行的方案，成功解決了大質(zhì)粒難克隆的問題。 本文第二部分，以蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171為研究對象，對蘇云金芽胞桿菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究，從而進一步認識Enhanci

5、n蛋白在促進Bt感染昆蟲中的作用。根據(jù)已知的Enhancin蛋白基因序列設計特異引物，以BMB171菌株的基因組DNA為模板，能擴增出對應的預期目的片段Enhancin蛋白基因。經(jīng)測序分析其預計蛋白質(zhì)由742個氨基酸組成，其氨基酸序列與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的昆蟲病毒的增效蛋白有20％左右的序列一致，與鼠疫桿菌的增效蛋白同源性在31％以上。利用同源重組敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因，構建了突變株BMBl084。將表達殺蟲晶體蛋白基因