蘇云金芽胞桿菌大質(zhì)粒pBMB165的克隆與分析.pdf

1、本論文以蘇云金芽胞桿菌為研究對(duì)象，克隆并繪制了質(zhì)粒pBMB165的物理圖譜，同時(shí)對(duì)蘇云金芽胞桿菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。 本文第一部分，以蘇云金芽胞桿菌擬步行甲亞種(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis，H<,8ab>)菌株YBT-1765為出發(fā)菌株，對(duì)其可檢測(cè)到的最大質(zhì)粒pBMB165進(jìn)行克隆分析研究。通過(guò)對(duì)YBT-1765總質(zhì)粒和全基因組DNA

2、分別進(jìn)行BamHI和HindlII不完全酶切，以pBeloBAC11為載體，成功構(gòu)建了蘇云金芽胞桿菌YBT-1765的基因組的細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)和質(zhì)粒的BAC文庫(kù)。根據(jù)已克隆的包含復(fù)制子oril65在內(nèi)的3.6kb片段(pBMB165-F4A)中編碼復(fù)制蛋白R(shí)ep165的核苷酸序列設(shè)計(jì)探針，通過(guò)染色體步移方式進(jìn)行篩選。在對(duì)質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，得到5個(gè)具有重疊關(guān)系的克隆子，測(cè)定這些克隆子的末端序列。根據(jù)這些末端序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)

3、染色體步移方式，對(duì)YBT-1765的基因組BAC文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得8個(gè)覆蓋質(zhì)粒pBMBl65不同區(qū)域的克隆子。測(cè)定這8個(gè)陽(yáng)性克隆子的末端序列，序列結(jié)果顯示它們之間存在著重疊群，并且能夠覆蓋整個(gè)質(zhì)粒pBMB165。通過(guò)對(duì)上述13個(gè)克隆子進(jìn)行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析，建立了質(zhì)粒pBMB165的物理圖譜和線狀重疊連鎖圖，并測(cè)算出該質(zhì)粒的大小為82kb。對(duì)其中一個(gè)陽(yáng)性克隆pBMB165A2作了序列測(cè)定：根據(jù)部分核苷酸序

4、列初步統(tǒng)計(jì)了pBMB165上轉(zhuǎn)座因子的存在機(jī)率，在pBMB165A2上轉(zhuǎn)座因子存在的機(jī)率值為40.5％，說(shuō)明pBMB165中存在豐富的轉(zhuǎn)座因子，YBT-1765菌株基因組文庫(kù)的構(gòu)建和物理圖譜的繪制為克隆蘇云金芽胞桿菌大質(zhì)粒提供了一套可行的方案，成功解決了大質(zhì)粒難克隆的問(wèn)題。 本文第二部分，以蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株BMB171為研究對(duì)象，對(duì)蘇云金芽胞桿菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Enhanci

5、n蛋白在促進(jìn)Bt感染昆蟲(chóng)中的作用。根據(jù)已知的Enhancin蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異引物，以BMB171菌株的基因組DNA為模板，能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的預(yù)期目的片段Enhancin蛋白基因。經(jīng)測(cè)序分析其預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)由742個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)病毒的增效蛋白有20％左右的序列一致，與鼠疫桿菌的增效蛋白同源性在31％以上。利用同源重組敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因，構(gòu)建了突變株BMBl084。將表達(dá)殺蟲(chóng)晶體蛋白基因