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文檔簡(jiǎn)介
1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)作為一種對(duì)人畜安全、無(wú)環(huán)境污染的微生物殺蟲(chóng)劑,在農(nóng)、林及衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治中發(fā)揮了重要的作用,成為國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)應(yīng)用最成功的一種微生物農(nóng)藥。因此深入發(fā)掘我國(guó)豐富的Bt資源,篩選具有高效廣譜殺蟲(chóng)活性的Bt菌株,并對(duì)其基因型進(jìn)行分析,克隆新型殺蟲(chóng)基因,這對(duì)微生物殺蟲(chóng)劑的研制、構(gòu)建高效廣譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物都具有重要的理論及實(shí)踐意義。本研究對(duì)四川雅安蒙頂山土壤中Bt資
2、源進(jìn)行了較為系統(tǒng)地調(diào)查研究,從中克隆到一個(gè)新的cry2型模式基因,并對(duì)其進(jìn)行了初步的表達(dá)研究,研究如下:
1.根據(jù)海拔高度和生態(tài)環(huán)境的不同,從蒙頂山采集了285份土壤樣本,采用醋酸鈉-抗生素法對(duì)土樣中Bt菌株進(jìn)行分離,獲得78株Bt菌株。土樣中Bt菌的平均分離率為19%。顯微鏡觀察顯示,分離出的Bt菌株產(chǎn)生形態(tài)各異的伴胞晶體,有長(zhǎng)菱形、短菱形、球形、方形、不定形等,充分顯示了蒙頂山生態(tài)區(qū)Bt資源多樣性的特點(diǎn)。利用PCR-R
3、FLP鑒定體系鑒定了78株Bt菌的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因類(lèi)型:其中68株含有cry1型基因,28株含有cry2型基因,2株含有cry3型基因,2株含有cry9型基因,3株含有cry4/10型基因,3株含有cry30型基因。用SDS-PAGE對(duì)這些菌株的殺蟲(chóng)晶體蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果表明:這些菌株主要表達(dá)4種大小的晶體蛋白,分子量在40-130kDa之間。對(duì)于沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的Bt菌株,其SDS-PAGE分析卻檢測(cè)到晶體蛋白,由此可推測(cè),這些菌株中可能
4、含有新型的殺蟲(chóng)基因。
2.用cry2型基因的通用引物鑒定出28株含有cry2型基因的Bt菌株,再用DdeⅠ內(nèi)切酶分別對(duì)它們的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株JF19-2的擴(kuò)增片段的酶切產(chǎn)物大小與已知的cry2型基因的酶切片段大小存在差異,說(shuō)明JF19-2中可能含有一個(gè)新的cry2型模式基因。
3.根據(jù)cry2型基因的通用引物對(duì)菌株JF19-2的擴(kuò)增序列,在序列的上游和下游分別設(shè)計(jì)特異引物SP1和SP2,采
5、用Tail-PCR技術(shù)獲得兩側(cè)的未知序列,將擴(kuò)增序列克隆并測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行拼接,得到了3,285bp的核苷酸序列,其中含有一個(gè)長(zhǎng)1,905bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼一個(gè)由635個(gè)氨基酸組成的蛋白,分子量為70.8kDa,等電點(diǎn)為9.18,該蛋白為弱堿性蛋白,其中異亮氨酸(Ile)、天冬酰氨(Asn)、色氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)四種氨基酸含量最高,分別為11.2%、10.57%、9.94%和8.36%。氨基酸同源
6、性比較發(fā)現(xiàn),其與Cry2Ab1蛋白同源性最高,為92%。該新基因已在GenBank中注冊(cè),其Accession number為ACH91610,被國(guó)際Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因命名委員會(huì)命名為cry2Ag1。
4.根據(jù)cy2Ag1基因ORF兩端序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物P1和P2。PCR擴(kuò)增獲得cry2Ag1完整ORF。將獲得的片段經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切,與構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b(+)連接,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET
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