蘇云金芽孢桿菌cry1Ab22基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Berliner，簡(jiǎn)稱Bt)是目前應(yīng)用最廣的一類微生物殺蟲劑，在過去的30多年中得到廣泛的研究和應(yīng)用。Bt的主要?dú)⑾x活性與其攜帶的編碼ICPs(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)的cry基因密切相關(guān)，因此，cry基因工程研究便成為近幾年研究的熱點(diǎn)。自Schnepf和Whiteley(1981)分離克隆了第一個(gè)Bt cry基因，到目前為止，國(guó)

2、際上已經(jīng)克隆了407種殺蟲蛋白基因，但是隨著Bt應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，Bt ICPs基因均在不同程度上引發(fā)了昆蟲的抗性，尋找新的高毒力菌株及基因是解決昆蟲抗性問題的有效途徑之一。 本研究利用PCR-RFLP法對(duì)蘇云金芽孢桿菌新菌株S249的cry1型基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其含有cry1Aa/cry1Ag、cry1Ab、cry1B基因，并根據(jù)GenBank中cry1Ab型基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)P-1，從蘇云金芽孢桿菌S249中擴(kuò)增得到cry

3、1Ab的全長(zhǎng)基因，克隆到pGEM-T Easy載體上。通過引物步行法測(cè)定該基因長(zhǎng)3633bp，其中開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)3468bp，編碼1155個(gè)氨基酸；經(jīng)ExPASy分析，初步預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為130.7kDa，等電點(diǎn)pI 5.04。序列比較結(jié)果表明，該基因與其它c(diǎn)rylAb基因存在6～58個(gè)氨基酸的差異，已在GenBank中登錄，登錄號(hào)為Eu220269，并被Bt毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)正式命名為cry1Ab22。將cry1Ab2

4、2基因克隆到表達(dá)載體pMAL-c2X上，得到重組質(zhì)粒pM1a，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1中，利用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h，目的蛋白約占總蛋白的17％。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株TB1能正確表達(dá)約170kDa的融合蛋白。對(duì)表達(dá)的cry1Ab22蛋白進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果表明，cry1Ab22蛋白對(duì)小菜蛾.Plutella xylostella 3齡幼蟲的LC50為225.1μg/ml。