蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)及其工程菌的構(gòu)建.pdf

1、從該室保存的Bacillus thuringiensis(Bt)菌株中,篩選出幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌株WB-7.根據(jù)已經(jīng)在GenBank上登錄的Bt幾丁質(zhì)酶基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物QCL1/QCL2,用PCR方法擴(kuò)增出的幾丁質(zhì)酶全長(zhǎng)基因,將PCR產(chǎn)物直接連接到pMD-18T克隆載體上轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中克隆得到2025bp包含氨基酸全序列的幾丁質(zhì)酶基因,并命名為Chi7,在GenBank上的登錄注冊(cè)號(hào)為AY074882.利用Blast軟件進(jìn)

2、行該基因的同源性分析,結(jié)果表明:chi7基因與已知的Bt和Bc幾丁質(zhì)酶基因都有90％以上的同源性;而與其它細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因同源性不高,如與Bacillus subtilis、Bacillus circulans的幾丁質(zhì)酶基因的同源性分別為50％、52％的.將chi7基因序列翻譯為Chi7蛋白質(zhì)氨基酸序列,該基因編碼674個(gè)氨基酸殘基.利用蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)Chi7蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明:經(jīng)在線(xiàn)的Smart軟件進(jìn)行氨基酸

3、的序列分析,推導(dǎo)出的Chi7蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)功能域包含有:7-26信號(hào)肽區(qū)、ChiA幾丁質(zhì)酶催化區(qū)、485-557類(lèi)纖連蛋白Ⅲ型區(qū)、579-672幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)4個(gè)結(jié)構(gòu)功能域;經(jīng)跨膜區(qū)分析在線(xiàn)軟件TMHMM2.0分析,表明Chi7蛋白前端的信號(hào)肽是跨膜信號(hào),同時(shí)SignalP分析也表明:Chi7蛋白的成熟加工剪切位點(diǎn)在第32-33的Ala-Asp間.用在線(xiàn)蛋白質(zhì)分析軟件ExPASy Proteomics tools進(jìn)行chi7蛋白結(jié)構(gòu)分析,

4、結(jié)果表明:在氨基酸殘基200-300間有可能存在coiled coil區(qū)域,整個(gè)蛋白質(zhì)中沒(méi)有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu);在蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有19.56％的螺旋結(jié)構(gòu)、25.78％的折疊結(jié)構(gòu)、54.67％的成環(huán)結(jié)構(gòu);整個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)呈緊密的球狀.構(gòu)建pBluescript SK原核表達(dá)載體在E.coli中檢測(cè)到Bt幾丁質(zhì)酶活性,但是表達(dá)的Bt幾丁質(zhì)酶活性不高.將Bt chi7基因連接到枯草芽孢桿菌(Bs)表達(dá)載體pUS186,電激轉(zhuǎn)化到Bs菌株QB