高效表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因tchiB蘇云金芽胞桿菌工程菌的構(gòu)建及殺蟲活性研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringinsis)是目前最為重要的一種殺蟲微生物，廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Bt工程菌的改造擬在完善其殺蟲譜較窄、殺蟲毒力不高等缺陷，獲得性能優(yōu)良的Bt重組工程菌。有研究報(bào)道幾丁質(zhì)酶能夠破壞昆蟲體內(nèi)的圍食膜，對(duì)Bt殺蟲晶體蛋白的殺蟲活性有著顯著的增效作用。
　　 本研究利用Red/ET同源重組技術(shù)，將煙草幾丁質(zhì)酶基因tchiB置于cry2Aa基因啟動(dòng)子和cry1Ac基因終

2、止子序列之間，獲得嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act。將嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act克隆入穿梭載體pHT315中，獲得重組質(zhì)粒pHTtchiB。將pHTtchiB電轉(zhuǎn)入高毒力Bt庫(kù)斯塔克亞種(Btsubsp.kurstaki)野生菌株HD73中，獲得工程菌株HDtchiB。經(jīng)SDS-PAGE分析檢測(cè)，外源基因于Btcry2Aa強(qiáng)啟動(dòng)子下高效表達(dá)產(chǎn)生約30kD蛋白；經(jīng)質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定其正確表達(dá)。用DNS法測(cè)定煙草幾

3、丁質(zhì)酶的活性，16h左右酶活力達(dá)到最高，為42.827U/mL。HD73和工程菌株HDtchiB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲的生物活性測(cè)定，72h的LC50分別為264.255μg/mL和167.870μg/mL，較出發(fā)菌株HD73顯示出更高的殺蟲毒力。
　　 外源質(zhì)粒在Bt工程菌株中容易出現(xiàn)不穩(wěn)定甚至丟失的情況。為了使外源基因能夠穩(wěn)定的存在于Bt工程菌中，將其整合入Bt染色體是有效措施。本研究選取定位在Bt染色體上的幾丁質(zhì)酶基因作

4、為外源基因的整合位點(diǎn)，構(gòu)建E.coli-Bt溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKCHIUN。利用Red/ET同源重組技術(shù)，構(gòu)建了含嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act的整合載體pKTCHIUN。擬通過同源重組，將pcry2Aa-tchiB-1Act基因定點(diǎn)整合到Bt無晶體突變株XBU001染色體上，獲得外源基因穩(wěn)定遺傳及表達(dá)的Bt工程菌株。
　　 本文利用Red/ET同源重組技術(shù)便捷高效地構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體pHTtchiB及整合載體p