腸道菌對蘇云金芽胞桿菌棉鈴蟲殺蟲活性的作用.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)由于在生長發(fā)育過程中會伴隨芽胞的形成而高效表達(dá)對昆蟲具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白,被廣泛應(yīng)用于害蟲防治上。在探討蘇云金芽胞桿菌殺蟲機制的過程中,很多研究者認(rèn)為昆蟲腸道共生菌是殺蟲活性所必須,也有研究者提出與此相反的觀點,形成了百家爭鳴的局面。本文以棉鈴蟲為供試?yán)ハx,以棉鈴蟲腸道共生菌為切入點,來探究昆蟲腸道共生菌在蘇云金芽胞桿菌發(fā)揮毒力的過程中所扮演的角色,從而求證棉鈴蟲腸道共

2、生菌是否為蘇云金芽胞桿菌發(fā)揮毒力所必須。
　　 首先,從人工飼養(yǎng)的普通棉鈴蟲腸道環(huán)境分離得到了9株細(xì)菌,其中8株革蘭氏陽性球菌,1株革蘭氏陰性球菌。從不同細(xì)菌出現(xiàn)的數(shù)量和在棉鈴蟲不同齡期的分布特征可以知道,3號菌出現(xiàn)的頻率較高,2號菌和7號菌在腸道內(nèi)數(shù)量較多,達(dá)到了108,2號、3號和7號菌是棉鈴蟲腸道的優(yōu)勢菌群。
　　 其次,用滅菌的普通飼料中加入終濃度為500μg/mL的氨芐青霉素(Amp)、鏈霉素(Str)、利福霉

3、素(Rif)和慶大霉素(Gen)的方法來獲得無腸道共生菌的棉鈴蟲。通過稀釋涂布法發(fā)現(xiàn)普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道解剖液在NA平板上會有黃色、白色或者紅色菌落出現(xiàn),無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道解剖液在NA平板上沒有菌落出現(xiàn)。說明無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道內(nèi)沒有可培養(yǎng)的細(xì)菌存在。通過液體富集法發(fā)現(xiàn)普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道第二次富集液平均OD600為1.773,無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道第二次富集液平均OD600為0.004。進一步說明無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴

4、蟲腸道內(nèi)沒有可培養(yǎng)的細(xì)菌存在。提取普通飼料和無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲腸道總DNA,擴增16S rDNA,結(jié)果顯示普通飼料飼養(yǎng)的1齡、2齡和3齡棉鈴蟲都有1.5 kb的條帶出現(xiàn),無菌飼料飼養(yǎng)的1齡、2齡和3齡棉鈴蟲都沒有特異性條帶的出現(xiàn)。說明用滅菌飼料中加入抗生素的方法可以將棉鈴蟲腸道內(nèi)細(xì)菌消除。
　　 同時比較用普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲和無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲的生長狀態(tài)和存活率。相同條件下飼養(yǎng)的相同批次的不同組棉鈴蟲生長狀態(tài)和存活率接近。

5、普通飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲,3齡和6齡時的平均體重分別為38.75 mg/頭和223.25 mg/頭,平均存活率分別為90.25％和86.00％;無菌飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲,3齡和6齡時的平均體重分別為37.50 mg/頭和231.00 mg/頭,平均存活率分別為89.50％和87.00％。
　　 隨后,用Cry1Ac10毒素蛋白對普通棉鈴蟲和無腸道共生菌棉鈴蟲進行生物測定實驗,結(jié)果表明,Cry1Ac10毒素蛋白對普通棉鈴蟲和無腸道共生菌棉

6、鈴蟲的LC50分別為0.0579±0.0389 mg/mL和0.0143±0.0054 mg/mL,對兩種品系的棉鈴蟲都有較高的毒力,而且Cry1Ac10毒素蛋白對無腸道共生菌棉鈴蟲的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對普通棉鈴蟲的毒力,是普通棉鈴蟲毒力的4倍。
　　 將從普通棉鈴蟲腸道篩選得到編號為3號的細(xì)菌,活化后混勻到無菌感染飼料中,感染棉鈴蟲幼蟲。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3號菌可以降低無腸道共生菌棉鈴蟲對Cry1Ac10的敏感性,使無腸道共生菌棉鈴蟲的死亡