蘇云金芽胞桿菌抗病殺蟲和廣譜工程菌的構(gòu)建.pdf

1、該論文用cry3Aa啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的aiiA基因和vip83基因,通過穿梭載體電轉(zhuǎn)化蘇云金芽胞桿菌高毒力細(xì)胞工程菌株YBT-833-2-1和高毒力野生菌株YBT-1520,構(gòu)建了一株抗植物軟腐病且具殺蟲活性的工程菌和一株廣譜工程菌.研究了芽胞桿菌CTC菌株伴胞晶體的形態(tài)發(fā)生,觀察到CTC菌株的S-層結(jié)構(gòu),證實(shí)CTC菌株的S-層蛋白可以形成伴胞晶體.主要結(jié)果如下:1.蘇云金芽胞桿菌抗病殺蟲工程菌的構(gòu)建 該研究將轉(zhuǎn)錄不依賴芽胞形成的蘇云金芽

2、胞桿菌cry3Aa基因的啟動(dòng)子替換基因aiiA自身的啟動(dòng)子,構(gòu)建了基因pro3A-aiiA.基因pro3A-aiiA插入穿梭載載體并電轉(zhuǎn)化對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的細(xì)胞工程菌株YBT-833-2-1,得到工程菌BMB821A.工程菌BMB821A對(duì)自身誘導(dǎo)物AHLs分子的降解活性和對(duì)歐文氏菌感染植物組織的抑制能力比出發(fā)菌株大大增強(qiáng),對(duì)鱗翅目害蟲甜菜夜蛾的殺蟲毒力LC<,50>值為3.426μL/mL,與出發(fā)菌株的LC<,50>值2.912μL

3、/mL相比無(wú)顯著差異.至今國(guó)內(nèi)外尚未見有其它殺蟲抗病雙重活性的Bt工程菌報(bào)道.2.蘇云金芽胞桿菌廣譜工程菌的構(gòu)建 蘇云金芽胞桿菌的營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip是一種在營(yíng)養(yǎng)期開始表達(dá)的可溶性蛋白,對(duì)小地老虎和甜菜夜蛾具有特異高毒力.用cry3Aa基因的啟動(dòng)子替換基因vip83自身的啟動(dòng)子,構(gòu)建了基因pro3A-vip.基因pro3A-vip在無(wú)晶體突變株BMB171中的蛋白表達(dá)量和蛋白對(duì)小菜蛾的毒力均高于基因vip83.將pro3A-vip基因插

4、入穿梭載體然后電轉(zhuǎn)化對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的野生菌株YBT-1520,得到工程菌BMB218V.工程菌表達(dá)的Vip蛋白依然為可溶性蛋白.工程菌對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲毒力比出發(fā)菌株提高了11倍,對(duì)棉鈴蟲則保持原有的高毒力.該研究在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了用pro3A-vip基因構(gòu)建廣譜Bt工程菌.通過剪接重疊PCR法,將crylC基因中負(fù)責(zé)編碼與晶體形成有關(guān)的片段與vip基因毒力核心片段融合在一起,構(gòu)建了融合基因vip-lC,該基因在無(wú)晶體突變株中表達(dá)形成了

5、90kD分子量大小的蛋白.3.芽胞桿菌菌株CTC的S-層蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以形成伴胞晶體 芽胞桿菌菌株CTC晶體蛋白N-端序列和基因核苷酸全序列經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)與炭疽芽胞桿菌的S-層蛋白具有92﹪和87.5﹪的同源性,顯示該菌株可能具有S-層結(jié)構(gòu).該研究結(jié)果表明菌株CTC在營(yíng)養(yǎng)期細(xì)胞壁外可形成S-層結(jié)構(gòu),在細(xì)胞內(nèi)可形成S-層的初體結(jié)構(gòu),在芽胞形成期可于細(xì)胞內(nèi)形成伴胞晶體,并隨芽胞的成熟而釋放出來;結(jié)合氨基酸和核苷酸的序列同源性,進(jìn)一步說明伴胞晶體