四川生態(tài)區(qū)蘇云金芽胞桿菌資源的篩選鑒定及其新型殺蟲基因的克隆表達(dá)研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)是目前研究最深入、使用最廣泛的殺蟲微生物之一。深入發(fā)掘我國豐富的蘇云金芽胞桿菌資源，篩選高毒力及特異性菌株，對其基因型進(jìn)行分析，分離克隆新型殺蟲基因，其結(jié)果對微生物殺蟲劑的研制、構(gòu)建高效廣譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物都具有重要的理論及實(shí)踐意義。本研究對四川盆地不同生態(tài)區(qū)的Bt資源進(jìn)行了較為系統(tǒng)的調(diào)查研究，從中分離克隆了數(shù)個新型殺蟲基因，并進(jìn)行了初步的表達(dá)研究，具體

2、結(jié)果如下： 1.采集四川不同生態(tài)區(qū)的土壤樣品2650份，利用醋酸鈉-抗生素法分離Bt菌791株，平均分離率為13.2％。分離出的菌株產(chǎn)生的伴胞晶體形態(tài)各異，有長菱形、短菱形、大菱形、小菱形、方形、球形、不定形等，充分顯示了四川生態(tài)區(qū)Bt菌株資源多樣性的特點(diǎn)。利用PCR-RFLP鑒定體系鑒定了791株Bt菌的殺蟲晶體蛋白基因類型：其中522株含有cry1型基因，312株含有cry2型基因，20株含有cry3型基因，33株含有cry

3、9型基因，28株含有cry4/10型基因，33株含有cry30型基因，3株含有cry40型基因。有80株菌未鑒定出基因型，對這些菌株的伴胞晶體SDS-PAGE分析結(jié)果表明：有的菌株表達(dá)130kDa和60kDa的蛋白；有的菌株表達(dá)90kD和40kDa的蛋白：有的菌株表達(dá)60kDa的蛋白；有的則表達(dá)90kDa左右的蛋白，可以推測，這些菌株極有可能含有新型的殺蟲基因。 2.系統(tǒng)地研究了四川生態(tài)條件下分離的Bt菌株Rpp02和Rpp39

4、的生物學(xué)特性。根據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、細(xì)胞壁化學(xué)組分和生理生化分析，Rpp02菌株被定名為蘇云金芽孢桿菌莫里遜亞種(Bacillusthuringiensissubsp.morrisoni)，Rpp39被定名為蘇云金芽孢桿菌殺蟲變種(Bacillusthuringiensisvar.entomocidus)。Rpp02生長3h進(jìn)入對數(shù)生長期，生長速率略快于Rpp39(4h)，Rpp39與已知標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1生長速率相當(dāng)。Rpp02產(chǎn)生大

5、菱形、小菱形、圓形、不定形伴胞晶體，Rpp39產(chǎn)生菱形、方形和圓形伴胞晶體。PCR-RFLP鑒定結(jié)果表明Rpp02含有crylAb，crylAc、crylCa和crylla四種基因，Rpp39含有crylAa、crylAb、crylAc、crylla和cry2Aa五種基因。SDS-PAGE電泳分析Rpp02主要產(chǎn)生130kDa和40kDa大小的蛋白，Rpp39主要產(chǎn)生130kDa和60kDa的蛋白。 3.設(shè)計(jì)了一對cry1Ac基

6、因的特異引物，對Rpp02菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約4kb的產(chǎn)物。測序結(jié)果表明，克隆到的片段含有一個較大的ORF框，該基因編碼區(qū)為3534bp，編碼1177個氨基酸，分子量為133.144kDa；等電點(diǎn)pI=4.825，為弱酸性蛋白質(zhì)；亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)3種氨基酸含量最高，分別為7.98％、7.81％、7.73％。與已報道的cry1Ac序列源性達(dá)到99％，存在著幾個核苷酸以及編碼氨基酸的差

7、別。該基因序列的Accessionnumber為DQ285666，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會命名為cry1Ac20。該基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的殺蟲效果。 4.以Rpp39為出發(fā)菌株，分離克隆了cry2Aa類殺蟲晶體蛋白全長基因。序列分析顯示該基因的開放閱讀框(ORF)為1902bp，編碼由634個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。其氨基酸序列與Cry2Aa1蛋白同源性為99.7％，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名

8、委員會命名為cry2Aa12。根據(jù)cry2Aa12基因ORF兩端序列，設(shè)計(jì)1對特異引物P3/P4，PCR擴(kuò)增獲得cry2Aa12完整ORF。將獲得的片段與大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a連接，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-2Aa。將該質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能正常表達(dá)，SDS-PAGE電泳驗(yàn)證含有65kDa表達(dá)蛋白。生物活性測定表明表達(dá)的包涵體蛋白對小菜蛾和二化螟具有殺蟲活性，LC50分別為5.4μg/mL和22

9、.3μg/mL。 5.采用PCR-RFLP鑒定法，從菌株BtMC28中挖掘出一個新型殺蟲模式基因，其部分序列與已知模式基因cry4Aa和cry10Aa的同源性分別為57％和60.5％。進(jìn)一步采用Tail-PCR和Son-PCR技術(shù)獲得了基因的全長序列。該基因的編碼區(qū)為2022bp，編碼673個氨基酸組成的蛋白，與Cry10Aa蛋白所氨基酸序列同源性最高為38％；其分子量為76.32kDa；異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、天

10、冬酰胺(Asn)含量最高，分別為9.65％、9.36％、8.91％；它的等電點(diǎn)為7.535，屬弱堿性蛋白。該新基因已在GenBank中注冊，Accessionnumber為EU339367。根據(jù)cry基因國際命名原則(即新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的氨基酸序列與已知蛋白同源性在45％以下為第一分類等級，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如cry1、cry2，cry3…)，該基因被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry54Aa1基因。根據(jù)cry54Aa1