蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)研究.pdf

1、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative。insecticidal proteins，VIPs)是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在對數(shù)生長中期分泌的一類新型殺蟲毒蛋白。通過改造微生物來源的新型高毒力營養(yǎng)期殺蟲蛋白VIP基因的核苷酸序列，優(yōu)化植物喜好密碼子，可以提高該基因在植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。 本實(shí)驗(yàn)利用中國科學(xué)院微生物研究所改造的VIP基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438v，VIP基因的表達(dá)由

2、組成型的35S啟動子驅(qū)動，胭脂堿合成酶基因的NOS終止子終止。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，通過抗性篩選、再生芽伸長、生根等組織培養(yǎng)，獲得100多棵抗性轉(zhuǎn)基因再生植株。對轉(zhuǎn)基因煙草再生植株進(jìn)行分子檢測，轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR檢測結(jié)果顯示陽性率為79.3％。為了確定外源基因的插入，從中選出6棵陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步進(jìn)行PCR.Southern雜交檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株與陽性對照一樣有特異性條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隂]有這條特異性條帶

3、。雖然PCR-Southern雜交不能反映外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)，但通過特異條帶的有無可以證明VIP基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到煙草基因組DNA上。 對26株P(guān)CR陽性植株進(jìn)行抗斜紋夜蛾活性檢測，以未轉(zhuǎn)基因煙草葉片作為對照。飼喂轉(zhuǎn)基因煙草葉片5d后，斜紋夜蛾幼蟲的平均矯正死亡率為88.5％，而未轉(zhuǎn)基因的對照植株對斜紋夜蛾則不表現(xiàn)抗性。其中的兩個株系vt和tvt分別為66.7％和87.5％。而其它四個株系均為100％0這可能是由于外源基

4、因在植物體內(nèi)表達(dá)差異引起的。通過Northem blot和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證外源基因在再生植株中的表達(dá)情況。其中Northem blot結(jié)果表明6個轉(zhuǎn)基因植株中有5個得以表達(dá)，Vt株系沒檢測到表達(dá)信號，tvt信號比較弱。而Western blot檢測結(jié)果也同樣顯示，vt株系沒有特異性蛋白帶出現(xiàn)，其它5個株系蛋白均得到特異表達(dá)，但是表達(dá)量不同。 分子生物學(xué)檢測和對斜紋夜蛾的抗蟲性檢測結(jié)果，都表明在轉(zhuǎn)基因煙草中，蘇云