蘇云金芽孢桿菌兩類殺蟲蛋白的遺傳改良和抗蟲性評價.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)在產(chǎn)胞期間可以分泌一種伴胞晶體蛋白(ICP)，對鱗翅目鞘翅目等昆蟲（比如小菜蛾）有很強的殺傷作用，目前已被深入研究和廣泛使用，土豆、棉花等轉(zhuǎn)Bt基因作物已得到大規(guī)模商業(yè)化種植。但是，長期單一使用ICP類殺蟲蛋白有可能導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性或者交叉抗性。蘇云金芽胞桿菌在營養(yǎng)生長期間，還會分泌一種與ICPs無氨基酸序列同源性、殺蟲機理完全不同的蛋白，即營養(yǎng)期殺蟲蛋白(

2、vegetativeinsecticidal proteins，VIPs)，對一些對ICPs不敏感的害蟲也有殺蟲活性，并且不會發(fā)生交叉抗性。根據(jù)已經(jīng)報道過的對不同害蟲有著抗性的vip基因，對這些基因的結(jié)構(gòu)域與功能域進行相互組合拼接，并根據(jù)植物密碼子偏好作了一定改造，共設(shè)計合成了14個vip新基因，旨在改造出能抗螟蟲的新型vip基因資源，為開發(fā)新型的水稻抗蟲基因、避免靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性或者交叉抗性提供技術(shù)基礎(chǔ)。另外，對實驗室內(nèi)抗蟲效果良

3、好的Bt基因做了一定的修飾并命名為mBt，希望能夠獲得毒性更強、殺蟲效果更好的抗蟲資源。
　　 將人工合成好的14個vip基因連入表達載體pSB130actin-nos，mBt基因則連入表達載體pSB130。兩個表達載體驅(qū)動目的基因表達的啟動子為水稻肌動蛋白actinI啟動子，終止子則為人工合成的nosT。連入目的基因后表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將攜帶有目的基因的T-DNA區(qū)整合到水稻染色體基因組中，經(jīng)PCR分子檢測后獲得了轉(zhuǎn)不同基因

4、的材料。將得到的轉(zhuǎn)vip基因材料分三套分別種植于浙江大學(xué)網(wǎng)室、浙江大學(xué)長興基地、武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。在稻縱卷葉螟、二化螟發(fā)蟲期間對這三個地點的材料分別進行了蟲害調(diào)查，并且對種植于華農(nóng)的材料進行了室內(nèi)接蟲鑒定（二化螟），最后根據(jù)田間調(diào)查得到的數(shù)據(jù)并結(jié)合華農(nóng)實驗室兩次室內(nèi)接蟲鑒的數(shù)據(jù)，初步認(rèn)定有2個vip基因（5號，6號）對螟蟲存在著不同程度的抗性。轉(zhuǎn)mBt材料通過室內(nèi)接蟲鑒定發(fā)現(xiàn)其對螟蟲有著較強的抗性，高于修飾之前的Bt基因，田間調(diào)