蘇云金芽孢桿菌cry1Ac與蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11融合表達及其功能研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱 Bt)是目前世界上應用范圍最廣的殺蟲微生物。但是野生型的Bt菌株存在殺蟲譜窄、毒力低等缺點，因此必須通過現(xiàn)代分子生物學技術(shù)構(gòu)建高效廣譜的Bt 工程菌來滿足生產(chǎn)的需要。本研究利用融合基因技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌crylAc基因與蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11融合獲得了毒力高、殺蟲譜廣的工程菌株，并且對其功能進行了初步的研究。 1．crylAc基因與蛛毒蛋白酶抑制劑

2、基因hwtx-11 融合基因的構(gòu)建 利用Bt偏愛密碼子優(yōu)化設(shè)計虎紋捕鳥蛛(Selenocosmia huwena)蛛毒蛋白酶抑制劑基因hwtx-11和腸激酶位點序列(Enterokinase site，簡稱EK site)，然后進行化學合成。對合成片段進行磷酸．化退火連接，與經(jīng)Bgl Ⅱ和MifeⅠ雙酶切的含crylAc的目的片段相連接，獲得pUA11中間質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，將融合基因片段克隆進穿梭載體pHT31

3、5中，獲得表達載體pHA11。將表達載體pHA11電轉(zhuǎn)化無晶體突變株Cry<'->B，獲得重組菌株BHA11。同樣，將攜帶crylAc基因的表達載體pHAc電轉(zhuǎn)化無晶體突變株Cry<'->B，獲得對照株BHAc。經(jīng)SDS-PAGE和Westem blot分析，CrylAc-HWTX-11 融合蛋白在無晶體突變株中得到表達，其相對分子量約為136.6 kDa。對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)和棉鈴蟲(Heli

4、coverpa armigera)幼蟲進行的生測結(jié)果顯示，BHA113d的LC<,50>值分別為12.3μg/ml和23.7μg/ml，BHAc 3d的LC<,50>值分別為19.1μg/ml和30.6μg/ml，BHA11菌株的殺蟲毒力是BHAc菌株的1.6倍和1.3倍。 2.CrylAc C-端缺失對融合表達的影響 將攜帶融合基因的pHA11質(zhì)粒進行Xho Ⅰ和Bgl/Ⅱ酶切，然后分別用 T4 DNA 聚合酶和綠豆芽

5、核酸酶補平，構(gòu)建缺失1.7kb crylAc C-端的重組質(zhì)粒 pHA11T。將表達載體 pHA11T 電轉(zhuǎn)化無晶體突變株Cry<'->B，獲得重組菌株 BHA11T。經(jīng) SDS-PAGE 和 Western blot 分析，pHA11T在無晶體突變株中得到表達，BHA11T表達的融合蛋白相對分子量約為74.3 kDa。生測結(jié)果顯示，BHA11T對甜菜夜蛾和棉鈴蟲幼蟲具有殺蟲活性，其LC<,50>值分別為34.7μg/ml 和 63.7

6、μg/ml，與BHAc 菌株相比，BHA11T 菌株毒力分別降低了0.8倍和1.1倍。 3.CrylAc與蛋白酶抑制劑HWTX-11 的協(xié)同作用 將化學合成的蛛毒蛋白酶抑制劑基因 hwtx-11 克隆至載體pGEX4T-1上，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。重組菌株在IPTG誘導下，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明，表達的GST-HWTX-11 融合蛋白的相對分子量約為33 kDa。對重組菌株

7、誘導表達后的產(chǎn)物進行生物活性測定，GST-HWTX-11 融合蛋白對甜菜夜蛾和棉鈴蟲在3d時的LC<,50>分別為86.6μg/ml 和 119.4μg/ml；其與CrylAc 對甜菜夜蛾和棉鈴蟲幼蟲毒力也有明顯的協(xié)同作用。 為了在蘇云金桿菌中高效表達crylAc和hwtx-11的融合基因，本研究在實驗設(shè)計上進行了多重優(yōu)化。首先，采用crylAc基因的BtⅠ、BtⅡ雙重疊啟動子來啟動融合基因的表達。該啟動子是蘇云金桿菌中最普遍存

8、在的一類強啟動子，適合在無晶體突變株Cry<'->B中啟動融合基因的表達。其次，我們保留了crylAc基因終止子下游區(qū)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Poly (T)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄過程中能有效終止轉(zhuǎn)錄并使mRNA更穩(wěn)定，延長rnRNA的半衰期，保證了融合蛋白高效穩(wěn)定的表達。同時，為了將真核來源的hwtx-11基因在Bt中表達并發(fā)揮作用，我們采用Bt偏愛密碼子對hwtx-11的編碼序列進行優(yōu)化設(shè)計，并在融合基因間插入了腸激酶位點的編碼序列，以使融合蛋白

9、在昆蟲中腸能降解成有活性的CrylAc 和HWTX-11 蛋白。此外，本研究構(gòu)建了重組菌株BHA11T來研究CrylAc C-端對融合蛋白表達的影響。生測結(jié)果顯示其毒力比對照菌株BHA11有所降低，可能是因為CrylAc C-端富含半胱氨酸，而缺失CrylAc C-端的融合蛋白在表達時，不能形成二硫鍵，不能很好地形成晶體，從而很容易被降解。研究了HWTX-11與CrylAc的協(xié)同作用，它們之間具有良好的協(xié)同作用，這是由于它們的殺蟲機制不