蘇云金芽孢桿菌耐熱蛋白酶的菌株篩選、發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)特性的研究.pdf

1、從34株蘇云金芽孢桿菌中篩選到一株產(chǎn)耐熱蛋白酶菌株FZ62。首先，通過(guò)單因素篩選初步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，確定最佳氮源為酵母粉，碳源為葡萄糖；其次，采用二水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響產(chǎn)酶的因素進(jìn)行考察，從中篩選出有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素：酵母粉、葡萄糖和初始pH值；再次，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)該三因素進(jìn)行三水平優(yōu)化，獲得它們的最優(yōu)組合，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方(g/L)：酵母粉20.4，葡萄糖1.0，KH<,2>PO<,4> 2.5，M

2、gSO<,4>·7H<,>O 0.35，CaCO<,3> 0.5，初始pH值7.07。優(yōu)化后產(chǎn)酶水平從263.43 U/mL提高到1112.39 U/mL，實(shí)測(cè)值與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值僅為+5.66％的誤差。最后，發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明為：接種量2.14％，250mL 三角瓶裝液量為35mL，發(fā)酵溫度31℃，培養(yǎng)時(shí)間20h，產(chǎn)酶水平達(dá)到1288 U/mL。 對(duì)FZ62菌株耐熱蛋白酶的代謝過(guò)程進(jìn)行初步研究，酶生成與菌體生長(zhǎng)為耦聯(lián)過(guò)程。以L(fǎng)o

3、gistic方程和Luedeking-Piret方程為基礎(chǔ)，建立該菌發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型，求得模型參數(shù)，該動(dòng)力學(xué)模型與試驗(yàn)結(jié)果擬和程度較好。 采用鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析與Sephadex G-75分子篩柱層析等純化步驟對(duì)該酶進(jìn)行了純化。純化后，酶的比活力達(dá)802.40 U/mg，純化了10.49倍，酶活力回收率為38.38％。利用SDS-PAGE電泳測(cè)定

4、蛋白質(zhì)分子量38.91kDa。以酪蛋白為底物，酶促反應(yīng)符合米氏方程，米氏常數(shù)為K<,m>=4.8 g/L和V<,m>=322.58U/mL。該酶最適作用溫度為55℃，60C℃以?xún)?nèi)酶活力相對(duì)穩(wěn)定，最適作用pH 7.0，酶在pH值7～11較為穩(wěn)定。 研究金屬離子對(duì)耐熱蛋白酶酶活力的影響，在2mmol/L 離子濃度下，K<'+>、Mg<'2+>對(duì)酶促反應(yīng)有顯著的激活作用，Cu<'2+>、Mn<'2+>、Zn<'2+>有一定的抑制作用。