耐熱堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、在河南商丘的鹽堿地堆肥土壤樣中分離到一株耐熱的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株SR-15，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)。該菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，其產(chǎn)酶活力由370U/mL提高至1180U/mL，20升發(fā)酵試驗酶活達到1392U/mL。粗酶液經(jīng)分離純化后，得到比活力為3315.9U/mg的純酶。 在鹽堿地堆肥土壤中取十五份土樣，用無菌水稀釋后涂布于酪蛋白底物培養(yǎng)基上，將產(chǎn)生透明圈的菌株挑出，在55℃條件下用酪蛋白底物

2、培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，獲得一株透明帶寬度最大的菌株SR-15。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性研究及全自動菌種鑒定儀鑒定，結(jié)果為枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)。 通過單因子和正交試驗獲得高產(chǎn)蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米粉40g/L、黃豆粉40g/L、MgSO40.5g/L、NaCL10g/L、K2HPO41.0g/L，最適培養(yǎng)條件為起始pH值10.0、培養(yǎng)溫度45℃、搖瓶轉(zhuǎn)速190rpm、250mL三角瓶的裝液量10

3、0mL。20升發(fā)酵試驗，酶活達到1392U/mL，并且發(fā)酵時間縮短了8h。 發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨鹽析、SephadexG-75凝膠柱層析純化，得到比活力為3315.9U/mg的純酶，SDS-PAGE電泳測得分子量約27kDa。酶學(xué)特性研究表明，該酶最適pH為10，最適反應(yīng)溫度為60℃，在40℃～50℃范圍內(nèi)酶的穩(wěn)定性最好，在pH9-10條件下酶穩(wěn)定性相對較高，Ca2+、Mg2+對酶活有較明顯促進作用，Ag+對酶活有較較強抑制作用。